馬玲玲 鄧 燕 楊 柳* 張明明 劉利利

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復(fù)色1號方對小鼠B16黑素瘤細胞增殖及酪氨酸酶活性的影響※

馬玲玲 鄧 燕 楊 柳* 張明明 劉利利

（南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州 510515）

探討復(fù)色1號方對小鼠B16黑素瘤細胞增殖及酪氨酸酶活性的影響。采用MTT法測定不同濃度的復(fù)色1號方對小鼠B16黑素瘤細胞增殖的影響，多巴速率氧化法測定對酪氨酸酶活性的影響，對其結(jié)果進行統(tǒng)計分析。復(fù)色1號方濃度在0.001～0.01g/l,范圍內(nèi)對小鼠B16黑素瘤細胞的增殖與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05），0.05～0.1g/l濃度范圍內(nèi)對小鼠B16黑素瘤細胞的增殖與對照組相比有顯著意義（＜0.05），呈現(xiàn)一定的抑制作用；復(fù)色1號方在0.001～0.1g/l濃度范圍內(nèi)對小鼠B16黑素瘤細胞中酪氨酸酶活性的影響與對照組相比，各濃度含藥培養(yǎng)基組的A值均有顯著性差異（＜0.05），呈劑量依賴性激活作用。在0.001～0.01g/l濃度范圍內(nèi)，復(fù)色1號方的最佳激活濃度為0.01g/l。復(fù)色1號方?jīng)]有促進小鼠B16黑素瘤細胞增殖的作用；在一定濃度范圍內(nèi)（0.001～0.1g/l），對小鼠B16黑素瘤細胞酪氨酸酶的活性呈劑量依賴型激活作用。

復(fù)色1號方；小鼠B16黑素瘤細胞；酪氨酸酶

白癜風(fēng)是常見的色素障礙性疾病。色素的多少決定了皮膚顏色，酪氨酸酶是黑素合成的關(guān)鍵酶，對其活性的調(diào)節(jié)可以直接影響黑素的合成。復(fù)色1號方是南方醫(yī)科大學(xué)楊柳教授及其研究團隊在多年對白癜風(fēng)的研究基礎(chǔ)上得出的經(jīng)驗外用方，用于進展期白癜風(fēng)的治療。臨床實踐表明，復(fù)色1號方在白癜風(fēng)的治療中有良好的效果。本研究觀察了復(fù)色1號方水提取物對小鼠B16黑素瘤細胞增殖及酪氨酸酶活性的影響，為復(fù)色1號方治療白癜風(fēng)的作用機理探討提供實驗依據(jù)。結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物 復(fù)色1號方（組方：白蒺藜補骨脂紫草等，購于南方醫(yī)院中藥房）。

1.1.2 試劑 1640培養(yǎng)基（賽默飛世爾生物化學(xué)制品公司產(chǎn)品）；胎牛血清（杭州四季青公司）；MTT（四甲基偶氮唑藍）、左旋多巴、二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）、TritionX-100（美國Sigma公司）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 黑素瘤細胞株及來源 小鼠B16黑素瘤細胞株購于中國科學(xué)院上海細胞研究所。

1.1.4 主要儀器 倒置顯微鏡（Nikon公司），自動酶標儀（芬蘭Thermo公司）等。

1.2 方法

1.2.1 中藥水提取物制備 按復(fù)色1號方組方稱取各藥物（共180g），裝入陶瓷藥煲中，加適量蒸餾水浸泡30min，大火煎煮至水開后改小火煎煮40min，倒出藥液；剩余藥渣加適量水繼續(xù)煎煮30min，倒出藥液；合并2次藥液，過濾后，濃縮至100ml，每100ml相當(dāng)于原生藥1.8g，經(jīng)15000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10min后，0.22μm濾膜抽濾除菌，分裝，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng) 小鼠B16黑素瘤細胞培養(yǎng)及傳代參照文獻[1]方法。

1.2.3 B16黑素瘤細胞增殖的測定[2]采用甲基偶氮唑藍比色法（MTT法），具體步驟如下：取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化，調(diào)節(jié)細胞濃度為0.5×104個/孔后加入96孔培養(yǎng)板，每孔100ul，置5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，再分別加入等體積的不同濃度復(fù)色1號方水提取物的培養(yǎng)基（濃度為0.001、0.005、0.010、0.050、0.100g/L），每一濃度設(shè)5個復(fù)孔，并設(shè)對照組，以不含藥的培養(yǎng)液為對照組（細胞+培養(yǎng)基），不含細胞的培養(yǎng)液為空白對照組（培養(yǎng)基），各組培養(yǎng)基均含5%胎牛血清。5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)56h，于結(jié)束前加入MTT液（5mg/ml）20ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h，去MTT液，加入DMSO 150ul/孔，震蕩10min，置酶標儀于波長490nm處測各孔吸光度值A(chǔ)，以A表示細胞的增殖。計算細胞增值率，細胞增殖率=（A含藥組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。

1.2.4 酪氨酸酶活性測定[3]采用多巴速率氧化法，對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化，調(diào)節(jié)細胞濃度為0.5×104個/孔后加入96孔培養(yǎng)板，每孔100ul。過夜貼壁后，根據(jù)MTT實驗結(jié)果，加入等體積的0.001g/l、0.005g/l、0.1g/l濃度的受試液。以不含藥的培養(yǎng)液為對照組（細胞+培養(yǎng)基），不含細胞的培養(yǎng)液為空白對照組（培養(yǎng)基），每組5個復(fù)孔。培養(yǎng)56h后棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，每孔加入1% TritonX-100溶液50μl，迅速置-80℃凍存30min，隨后室溫融化使細胞完全破裂，加入0. 5%左旋多巴20μl，37℃反應(yīng)4h，酶標儀測定405nm吸光度值A(chǔ)，以A表示酪氨酸酶活性。酪氨酸酶活性率=（A含藥組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)色1號方水提取物對B16細胞增殖的影響 MTT實驗結(jié)果顯示，復(fù)色1號方濃度在0.001～0.01g/l對小鼠B16黑素瘤細胞增殖作用與單純培養(yǎng)基對照組相比無顯著意義（＞0.05），0.05～0.1g/l對小鼠B16黑素瘤細胞的增殖與對照組相比有顯著意義（＜0.05），呈現(xiàn)一定的抑制作用，見表1。

表1 復(fù)色1號方對小鼠B16黑素瘤細胞增殖的影響 （±s）

注：與對照組相比，*表示＜0.05

2.2 復(fù)色1號方水提取物對酪氨酸酶活性的影響 在0.001～0.01g/l濃度范圍內(nèi)，與對照組相比，各濃度含藥培養(yǎng)基組的A值均有顯著性差異（＜0.05），復(fù)色1號方對小鼠B16黑素瘤細胞中酪氨酸酶活性呈劑量依賴性激活作用。在0.001～0.01g/l濃度范圍內(nèi)（＜0.05），復(fù)色1號方的最佳激活濃度為0.01g/l。見表2。

表2 復(fù)色1號方對小鼠B16黑素瘤細胞中酪氨酸酶活性的影響 （±s）

注：與對照組相比，*表示＜0.05

3 討論

白癜風(fēng)是由皮膚和毛囊的黑色素細胞內(nèi)酪氨酸酶系統(tǒng)的功能減退或喪失而引起的常見色素脫失性疾病。因為有損美容，往往會給患者帶來嚴重的心理負擔(dān)和精神壓力。白癜風(fēng)的治療歷來都受到醫(yī)學(xué)界的重視，然至今仍沒有找到特效的治療方法。南方醫(yī)科大學(xué)楊柳教授及其領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊在多年的臨床實踐、理論和實驗研究中，總結(jié)出一套中西醫(yī)結(jié)合、內(nèi)外治結(jié)合、分期論治的治療方案。復(fù)色1號方即其中的一個成果，外用于進展期白癜風(fēng)局部皮損。我們認為在白癜風(fēng)進展期，多屬風(fēng)濕交雜、氣血不和導(dǎo)致肌膚失養(yǎng)出現(xiàn)白斑[4-5]，故本方的組方原則為祛風(fēng)除濕，調(diào)和氣血。

對于白癜風(fēng)的治療機理，筆者總結(jié)目前有幾個觀點：①促進黑素細胞增殖；②增強酪氨酸酶活性，促進黑素的生成、運轉(zhuǎn)；③抑制黑素細胞的破壞；④誘導(dǎo)刺激休止黑素細胞移行[6]；⑤調(diào)節(jié)黑素細胞內(nèi)Ca2+紊亂等[7]。本研究將復(fù)色1號方水提取物直接作用于黑素瘤細胞，以觀察其是否有通過促進黑素細胞增殖、增強酪氨酸酶活性這一機制以達到治療白癜風(fēng)的效果。

方中補骨脂、紫草等已有研究證實對黑素細胞增殖和酪氨酸酶活性有激活作用[8-9]。本研究顯示，復(fù)色1號方在各藥的聯(lián)合作用下，在一定的范圍內(nèi)（0.001～0.01g/l）對小鼠B16黑素瘤細胞無增殖作用，在較高濃度（0.05～0.1g/l）對小鼠B16黑素留細胞的增殖呈抑制作用。研究過程中得出這個結(jié)果與我們預(yù)想的結(jié)果有些出入，我們預(yù)想復(fù)色1號方對黑素瘤細胞的增殖應(yīng)呈促進作用。作者推想，本研究結(jié)果有可能是以下因素造成：①本實驗用的是腫瘤細胞，且是小鼠的體外培養(yǎng)的黑素瘤細胞，與正常的黑素細胞有區(qū)別。有研究顯示，本方中有些藥物如補骨脂[10]、苦參[11]及紫草[12]含有抗癌的成分，故本實驗中出現(xiàn)高濃度對小鼠B16黑素瘤細胞的抑制作用可能與此有關(guān)，但需進一步研究證實。②本實驗直接將藥液加入培養(yǎng)基中，不排除高濃度時藥物濃度刺激關(guān)系對細胞的殺傷作用。

本研究結(jié)果顯示，本方在一定濃度范圍內(nèi)（0.001～0.1g/l），對酪氨酸酶的活性呈劑量依賴型激活作用。表明本方可通過激活酪氨酸酶的活性進而促進色素的生成，進而有效治療白癜風(fēng)。

本研究只進行了復(fù)色1號方對小鼠B16黑素瘤細胞的影響，并未涉及其對人正常黑素細胞的作用、對黑素細胞周邊細胞的作用、對有關(guān)色素代謝的細胞因子等的作用及其在動物或人體內(nèi)的作用情況等問題，故本方對白癜風(fēng)的治療是否存在其他作用機制，仍需進一步的研究。

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（本文校對：王治華 收稿日期：2012-01-05）

Effects of Fuse Formula-1 on Cell Proliferation and Tyrosinase Activity of Cultured B16 Melanoma Cells

Ma Lingling Deng Yan Yang Liu Zhang Mingming Liu Lili

(The TCM College of Southern Medical University, Guangzhou 510515, China)

To study the effects of Fuse Formula-1 on cell proliferation and tyrosinase activity of cultured B16 melanoma cells.MTT method, DOPA-rate limiting method were employed to measure the cell viability and tyrosinase activity of B16 melanoma cells. And divided into experimental group (Fuse Formula-1), control group(bland control group), compared their results.Fuse Formula-1 concentration of 0.001～0.01g/l g /L for B16 melanoma cells had no effect (＞0.05), 0.05～0.1g/lg /L of Fuse Formula-1 on B16 melanoma cells for inhibition (＜0.05); 0.001-0.1g/l Fuse Formula-1for B16 melanoma cells, tyrosinase activity was in a dose-dependent activation.Fuse Formula-1 had no effect on cell proliferation of B16 melanoma cells, but exhibits a dose-dependent enhancing effects on tyrosinase activity in B16 melanoma cells.

Fuse Formula-1; B16 melanoma cells; proliferation; melanogenesis.

10.3969/j.issn.1672-2779.2012.06.100

1672-2779（2012）-06-0052-03

廣東省“211工程”三期重點學(xué)科建設(shè)項目[No：粵發(fā)改社（2009）431號]