吳周睿，胡 笑，徐 委，孫曉晴，管曉菲，程黎明

同濟大學附屬同濟醫(yī)院脊柱外科，上海 200065

骨科手術中需要使用大量自體骨和/或異體骨進行組織填充。然而目前骨質(zhì)資源匱乏，而且異體骨可能存在免疫排斥反應，對骨折愈合產(chǎn)生十分不利的影響。近五年來再生醫(yī)學領域中干細胞技術的廣泛應用為治療眾多人類疾病帶來革命性突破。目前已經(jīng)出現(xiàn)了許多干細胞治療各種人類疾病的研究報道錯誤!未找到引用源。。同樣，通過干細胞技術，理論上也能獲得大量患者自體或異體的骨質(zhì)。并且將取自患者自身的細胞培養(yǎng)、分化成適合進行移植的骨質(zhì)，能夠避免排斥反應，提高質(zhì)量效果和患者預后生活質(zhì)量。由于各種來源的干細胞形成骨質(zhì)的能力不同，與成骨母細胞來自同一發(fā)育起源的間質(zhì)干細胞成為首選種子細胞;而臍帶血間質(zhì)干細胞來源充足，取材簡便，成為最佳候選細胞。

但是目前干細胞成骨分化效率較低，其中具體分化機制也尚不明確。有證據(jù)表明DNMT3B在人胚胎期和出生后成骨分化過程中發(fā)揮了重要作用。另外在人類遺傳病ICF綜合癥中發(fā)現(xiàn)，DNMT3B突變可能會引起患者頜面部骨骼發(fā)育畸形，這些研究表明DNMT3B在成骨分化過程中十分重要錯誤!未找到引用源。。

為了進一步提高干細胞成骨分化的效率，明確DNMT3B與細胞成骨分化作用之間的關系，本實驗嘗試建立帶有DNMT3B基因沉默的人臍帶血間質(zhì)干細胞，并通過細胞培養(yǎng)、分化技術，分子學基因表達水平檢測和DNA甲基化水平檢測技術等，評價DNMT3B缺失后對人臍帶血間質(zhì)干細胞成骨分化造成的影響。

1 材料與方法

1.1 hUMSCs培養(yǎng)及鑒定

實驗中使用臍帶血間質(zhì)干細胞購自與Sciencell公司(貨號#7530)。將1×106的hUMSCs培養(yǎng)在T25培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為低糖 DMEM，5%胎牛血清，10 ng/ml血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，10 ng/ml表皮生長因子(EGF)，隔日換液。并通過使用表面標志物CD44和CD90抗體對hUMSCs進行免疫組織化學鑒定。

1.2 DNMT3B突變型hUMSCs建立

設計DNMT3B RNA特異性干擾靶點位于人DNMT3B cDNA 3＇UTR區(qū)，其結(jié)合特異性經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫 blast對比確認。在設計的21 bp siRNA序列中未發(fā)現(xiàn)明顯的人同源性序列。siRNA正義鏈序列為5＇-AACTGGAGCCACGACGTAACA-3＇，反 義 鏈 序 列 為 5＇-AACTGGAGCCACGACGTAACA-3＇。將此雙鏈置于1×siRNA退火緩沖液(6 mM HEPES(pH 7.4)，20 mM KCl和 0.4 mM Mg(OAC)2)中以90℃退火1分鐘后，置于37℃中培育1小時形成雙鏈。siRNA轉(zhuǎn)染時，將27 μg siRNA表達載體輕柔加入至 4.5 ml含有 45 μL Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑的Opti-MEM?轉(zhuǎn)染液中，室溫靜止孵育5分鐘。孵育完成后將含有質(zhì)粒和Lipo2000的Opti-MEM?轉(zhuǎn)染液加入至5×105hUMSCs中。37℃孵育過夜。感染第4天通過免疫組化染色和qPCR法檢查細胞感染效率。

1.3 成骨分化實驗

將hUMSCs種植于載玻片上，加入成骨細胞培養(yǎng)液中誘導分化2周，即可獲得Osteocalcin陽性的成骨細胞，隨后進行礦化功能染色鑒定。成骨細胞誘導分化液配方:DMEM+10%胎牛血清+L-抗壞血酸 100，β-甘油磷酸酯 10 mM，地塞米松 10 nM，非必需氨基酸5 ml，谷氨酰胺5 ml，雙抗5 ml。

1.4 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件完成。實驗資料用±s表示組間兩兩比較，采用單因素方差分析，當P＜0.05和P＜0.01時，有統(tǒng)計學顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 DNMT3B突變型hUMSCs建立

野生型hUMSCs購得后，按照該公司培養(yǎng)要求進行一定比例的擴增后進行實驗。獲得的細胞形態(tài)上具有間質(zhì)干細胞特征(圖1)。

圖1 野生型hUMSCs培養(yǎng)形態(tài)Fig.1 The morphology of hUMSCs

DNMT3B siRNA轉(zhuǎn)染hUMSCs后，免疫組織化學染色和qPCR法檢測內(nèi)源性DNMT3B表達水平。結(jié)果顯示獲得兩株DNMT3B突變型細胞(shD3B-1和shD3B-2)轉(zhuǎn)染效率約95%，兩株突變型hUMSCs中DNMT3B表達量分別下降至野生型hUMSCs的12.67 ±0.45%和35.60 ±0.76%(P ＜0.05，圖2)。

與野生型 hUMSCs相比，雖然這種兩株DNMT3B突變型hUMSCs也能夠表達特異性標記物CD44和CD90(圖3)，但是特異性標記物CD90和CD73 mRNA表達水平下降，shD3B-1和shD3B-2的 CD73水平是正常細胞的15.83±0.44%和16.60±0.37%(P ＜0.05);而 CD90 的水平是正常細胞的 35.23 ±0.30% 和 58.64 ±0.71%(P＜0.05)(圖4)。

圖2 RNA干擾后DNMT3B mRNA表達水平Fig.2 The expression level of DNTM3B after RNA interference

圖3 免疫組化染色顯示CD44和CD90表達水平Fig.3 The CD44 and CD90 expression were showed by immunostaining

2.2 DNMT3B突變型hUMSCs成骨細胞分化

圖4 qPCR結(jié)果顯示CD73和CD90 mRNA表達水平Fig.4 The CD73 and CD90 expression were showed by qPCR

成骨細胞分化兩周后，免疫組化染色顯示突變型和野生型hUMSCs細胞均能被誘導為表達Osteocalcin的成骨母細胞，但是DNMT3B突變型細胞信號強度比野生型細胞明顯較弱，而且成骨區(qū)域形態(tài)也不及野生型成熟(圖5)。

圖5 免疫組化染色顯示Osteocalcin在成骨細胞中表達水平Fig.5 The osteocalcin expression were showed by immunostaining

qPCR顯示三個與成骨直接相關的基因——RUNX2，IBSP和 ALPL在誘導分化兩周后的DNTM3B突變型hUMSCs中表達顯著低于野生型hUMSCs(圖 6)。其中 shD3B-1和 shD3B-2的RUNX2基因表達水平分別為正常細胞的55.09±0.53%和 53.77 ±0.47%;IBSP 基因表達水平分別為正常細胞的 53.21 ±0.81% 和 41.75 ±0.44%;ALPL基因表達水平分別為正常細胞的15.55±0.10%和 17.86 ±24%(P ＜0.01)。

進一步對成骨母細胞進行茜素紅染色(Alizarin Red Staining，ARS)檢測成骨后細胞功能。染色結(jié)果顯示DNMT3B突變型hUMSCs成骨功能低于野生型hUMSCs(圖7)。

圖6 qPCR結(jié)果顯示成骨相關基因在成骨細胞中的表達情況Fig.6 The RUNX2，IBSP and ALPL expression were showed by qPCR

圖7 礦化染色顯示成骨分化后細胞功能Fig.7 The function of osteogenesis was tested by alizarin red staining

3 討論與結(jié)論

為了進一步研究DNMT3B基因與間質(zhì)干細胞成骨分化的關系，本實驗通過RNA干擾技術抑制hUMSCs中內(nèi)源性DNMT3B表達，隨后進行終端成骨母細胞分化工作。實驗發(fā)現(xiàn):兩株DNMT3B突變型hUMSCs和野生型hUMSCs均能被誘導為表達Osteocalcin蛋白的成骨細胞，但是DNMT3B突變型hUMSCs來源的成骨細胞中成骨相關基因的表達(RUNX2，IBSP和 ALPL)比野生型成骨細胞低。而且免疫組織化學結(jié)果也證實了這一發(fā)現(xiàn)。在進行成骨母細胞功能性檢測實驗時發(fā)現(xiàn)DNMT3B突變型hUMSCs礦化染色活性都比野生型要低。這些結(jié)果認為DNMT3B突變或缺失會導致hUMSCs成骨分化能力下降。

DNMTs介導的DNA甲基化在高等哺乳動物胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用錯誤!未找到引用源。。同樣在成骨系統(tǒng)發(fā)育階段，DNMTs，尤其是de novo DNMTs介導的DNA甲基化也參與其中。作為DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶家族中重要的一員，DNMT3B在細胞中發(fā)揮了DNA新建型甲基化的作用。因此DNMT3B突變首先產(chǎn)生的影響是DNA甲基化的丟失。通常來講，DNA甲基化調(diào)控基因表達的主要機制分為三步:首先待轉(zhuǎn)錄基因啟動子區(qū)上CpG二核苷酸的甲基化會導致轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起始錯誤!未找到引用源;其次DNA甲基化還能通過胞嘧啶上的甲基基團與CpG甲基基團結(jié)合蛋白(methyl-CpG binding proteins，MBDs)，進一步從空間位置上阻礙轉(zhuǎn)錄因子與啟動子區(qū)結(jié)合。;另外MBD蛋白能促進組蛋白去乙酰化轉(zhuǎn)移酶(Histone deacetylase，HDACs)在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)募集，改變組蛋白的構(gòu)象，進一步抑制基因轉(zhuǎn)錄錯誤!未找到引用源。因此在DNMT3B表達狀態(tài)缺失情況下，hUMSCs中多能性基因的抑制狀態(tài)可能被解除，相反成骨相關基因表達被抑制。

值得一提的是，在成骨發(fā)育的過程中，成骨基因的表達是時序性調(diào)控的過程，首先RUNX2在分化初始階段(誘導開始4天以內(nèi))具有轉(zhuǎn)錄起始的作用，因此其表達最早出現(xiàn);ALPL作為普遍常見的骨形成基因在分化的中期(誘導后1周左右)出現(xiàn)峰值;而作為影響成骨成熟形態(tài)及功能的基因，Osteocalcin一般出現(xiàn)在誘導后2～3周時。本實驗中發(fā)現(xiàn)DNMT3B的缺失對同一時間點上三個不同階段的基因表達都具有抑制作用，因此不難推斷DNMT3B抑制成骨分化的靶點位于hUMSCs中，而不是成骨分化后期;同時由于DNMT3B主要存在于多潛能細胞中，在隨著終端分化的進行DNMT3B表達水平逐漸下降。另外CD73和CD90的mRNA水平從另一個方面佐證了DNMT3B缺失對hUMSCs自身的抑制作用。這三個證據(jù)都共同指出，DNMT3B對于hUMSCs的成骨分化具有重要的調(diào)控作用。在進一步實驗中對于成骨基因時序性表達的檢測可以更詳細的解釋DNMT3B對于成骨分化產(chǎn)生的影響。

另外，以免疫球蛋白水平低下，中心粒異染色質(zhì)區(qū)解凝和面部畸形為主要臨床表現(xiàn)的ICF(Immunodeficiency，Centromere instability and Facial abnormal)綜合征，已經(jīng)明確了DNMT3B基因突變是其主要遺傳學病因錯誤!未找到引用源。。由此可以認為，DNMT3B與人類骨質(zhì)結(jié)構(gòu)形成相關。目前還沒有證據(jù)表明使用DNMT3B重表達技術能夠逆轉(zhuǎn)成骨異常，但是在間質(zhì)干細胞體系中，將來可以通過分子生物學技術將DNMT3B過表達后評價其成骨狀態(tài)。而且新興的成體細胞重編程技術(reprogramming)能夠在體外完整的模擬ICF綜合征的發(fā)病過程，進一步明確DNMT3B在成骨細胞分化和骨質(zhì)形成中的具體作用機制。

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