喬 森，羅建紅，金靜華 綜述

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系、衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、浙江省神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058)

帕金森病是全球第二大神經(jīng)退行性疾病，同時(shí)也是最常見的運(yùn)動(dòng)障礙性疾病，目前，65歲以上人群中約有百分之一患帕金森病［1］。帕金森病的主要臨床癥狀是運(yùn)動(dòng)遲緩、僵直、震顫、嗅覺功能障礙、自律功能障礙、睡眠紊亂［2］。帕金森病的主要病理特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性死亡，以及出現(xiàn)異常聚集的α-Synuclein 構(gòu)成的路易氏小體［3-4］。盡管帕金森病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制還不清楚，但越來越多的研究表明，免疫炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激參與了帕金森病的發(fā)生發(fā)展過程［5-6］。

研究表明，免疫炎癥反應(yīng)參與了許多退行性疾病，如多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默癥、帕金森病的發(fā)生發(fā)展過程［7］。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)的主要參與細(xì)胞，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)改變細(xì)胞形態(tài)、產(chǎn)生氧自由基、抗炎因子(IL-10 等)、炎癥因子(TNF-α、IL-1β，IL-6 等)、增加吞噬能力［8］。流行病學(xué)資料以及動(dòng)物模型研究均提示小膠質(zhì)細(xì)胞的激活參與了帕金森病的發(fā)生發(fā)展過程［9，10］。由于逐漸認(rèn)識(shí)到小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和α-Synuclein 在帕金森病的發(fā)生發(fā)展中的重要作用，很多關(guān)于兩者以及兩者之間關(guān)系的研究已經(jīng)展開。

1 α-Synuclein 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

α-Synuclein 的編碼基因位于4 號(hào)常染色體，有7個(gè)外顯子。α-Synuclein 和β-Synuclein，γ-Synuclein 同屬于突觸核蛋白家族［11］，主要表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，高表達(dá)于皮層和海馬及黑質(zhì)的神經(jīng)元突觸前末端，在其他細(xì)胞如小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)，在正常狀態(tài)下，α-Synuclein 在神經(jīng)傳遞和突觸可塑性中發(fā)揮作用［12］。α-Synuclein 由140個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，最初作為阿爾茨海默癥中淀粉樣蛋白中非Aβ組分的前體被發(fā)現(xiàn)。α-Synuclein 主要包括三個(gè)部分:N 末端，NAC(非Aβ組分)結(jié)構(gòu)域，C 末端。N 末端包含4個(gè)KTKEGV 重復(fù)序列和3個(gè)與家族性帕金森病緊密關(guān)聯(lián)的突變位點(diǎn):E30P、E46K、A53T，N 末端主要參與α-Synuclein 與膜的結(jié)合以及α-Synuclein 的運(yùn)輸。NAC 區(qū)主要由疏水殘基構(gòu)成，有3個(gè)KTKEGV 重復(fù)序列和1個(gè)磷酸化位點(diǎn)，可以與Aβ 相互作用，促進(jìn)Aβ 聚集，參與阿爾茨海默癥發(fā)生發(fā)展進(jìn)程［13］，并且也促進(jìn)α-Synuclein 的異常聚集［14］。C 末端有1個(gè)磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)硝化位點(diǎn)，主要參與分子伴侶活性和降低α-Synuclein 的聚集［15-16］。

2 α-Synuclein 和炎癥的關(guān)系

2.1 α-Synuclein 在細(xì)胞之間的傳遞 雖然α-Synuclein 一直被認(rèn)為是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白，但是最近的研究發(fā)現(xiàn)，在正常個(gè)體和帕金森病患者的腦脊液與血液中有單體和寡聚體形式α-Synuclein 出現(xiàn)［17］，與正常人相比帕金森患者腦脊液和血液的寡聚體形式的α-Synuclein 水平顯著升高。而且有研究發(fā)現(xiàn)，α-Synuclein 單體和聚集化結(jié)構(gòu)可以很迅速地以不依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體的胞吐形式從細(xì)胞內(nèi)分泌出去［18］。Brundin 等研究發(fā)現(xiàn)，α-Synuclein 通過內(nèi)吞作用在相鄰細(xì)胞之間傳遞，這些通過內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞的α-Synuclein 跟胞質(zhì)內(nèi)原有的α-Synuclein 相互作用，進(jìn)一步加快α-Synuclein 的聚集，形成路易氏樣包涵體;這種α-Synuclein 的聚集作用在細(xì)胞之間的傳遞可能在帕金森病的病情發(fā)展惡化起到重要做用，這也為帕金森病發(fā)病過程中神經(jīng)元損傷從黑質(zhì)向其它腦區(qū)擴(kuò)散提供了新的解釋［19］。Lee 的研究小組測(cè)試了神經(jīng)元細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)胞外聚集化的α-Synuclein 的內(nèi)吞能力，以及隨后在細(xì)胞內(nèi)對(duì)α-Synuclein 的降解能力，發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)α-Synuclein 的內(nèi)吞和降解能力都是最強(qiáng)的，但是激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)α-Synuclein 的降解能力降低，導(dǎo)致α-Synuclein 在其胞質(zhì)中聚集。對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞不同狀態(tài)對(duì)α-Synuclein 的降解能力不同的研究提示，在帕金森病發(fā)病過程中小膠質(zhì)細(xì)胞激活后對(duì)α-Synuclein 的降解能力降低，可能會(huì)造成α-Synuclein 在小膠質(zhì)細(xì)胞中沉積，這會(huì)引起小膠質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)激活，并最終對(duì)多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生慢性長(zhǎng)期損害［20］。這些發(fā)現(xiàn)提示，細(xì)胞外的α-Synuclein 可能會(huì)在帕金森病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

2.2 α-Synuclein 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活作用細(xì)胞水平研究

2.2.1 聚集化α-Synuclein 激活小膠質(zhì)細(xì)胞的研究 α-Synuclein 能激活小膠質(zhì)細(xì)胞的證據(jù)最早來源于直接用聚集化的α-Synuclein 處理小膠質(zhì)細(xì)胞的研究。在這個(gè)研究中，小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)聚集化的α-Synuclein 的吞噬以及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的氧化，在聚集化的α-Synuclein 激活小膠質(zhì)細(xì)胞以及由此引發(fā)的神經(jīng)元毒性的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase，PHOX)敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞在聚集化α-Synuclein 刺激下，比正常的小膠質(zhì)細(xì)胞在同樣刺激條件下產(chǎn)生的神經(jīng)毒性少;這提示聚集化的α-Synuclein刺激小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基并最終對(duì)多巴胺能神經(jīng)元造成神經(jīng)毒性，這同時(shí)也暗示損傷或死亡的神經(jīng)元釋放的聚集化的α-Synuclein 會(huì)進(jìn)一步對(duì)神經(jīng)元造成長(zhǎng)期持續(xù)的損害［21］。Zhang 等人關(guān)于α-Synuclein 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活作用的后續(xù)研究提示，Scavenger 受體介導(dǎo)了α-Synuclein 的內(nèi)吞，但是對(duì)α-Synuclein 引起的小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的超氧化物的產(chǎn)生沒有明顯影響;MAC1 雖然沒有參與α-Synuclein 的內(nèi)吞，但是調(diào)節(jié)了超氧化物的產(chǎn)生。此項(xiàng)研究表明，α-Synuclein 可能通過與MAC1 直接結(jié)合，隨后活化PHOX 產(chǎn)生氧自由基，最終釋放到胞外的氧自由基對(duì)多巴胺能神經(jīng)元造成損傷［22］。雖然研究表明，正常狀態(tài)下出現(xiàn)的單體α-Synuclein 也有激活小膠質(zhì)細(xì)胞的能力，但是，在帕金森病病理狀態(tài)下出現(xiàn)的聚集化的α-Synuclein 比單體狀態(tài)下的α-Synuclein 有更強(qiáng)的刺激小膠質(zhì)細(xì)胞的能力，并最終對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生更強(qiáng)的傷害［23］。

Kim 等人研究了基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMP)途徑在外源性的聚集化的α-Synuclein 引起的小膠質(zhì)細(xì)胞激活中的作用，發(fā)現(xiàn)聚集化的α-Synuclein 刺激后，小膠質(zhì)細(xì)胞的MMP-3、MMP-8、MMP-9 表達(dá)升高，小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)釋放MMP，胞外環(huán)境中的MMP 可以通過PARs 受體激活小膠質(zhì)細(xì)胞，而在隨后的下游通路研究中發(fā)現(xiàn)，MMP-3、MMP-9 是通過與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的MAPK、NF-kB、和AP-1 通路發(fā)揮作用。MMP 可以通過自分泌和旁分泌的形式激活小膠質(zhì)細(xì)胞，這可能引起更大范圍的小膠質(zhì)細(xì)胞激活，并對(duì)神經(jīng)元造成更大范圍的損傷［24］。

2.2.2 硝化的α-Synuclein 激活小膠質(zhì)細(xì)胞的研究 α-Synuclein 在C 末端有三個(gè)硝化位點(diǎn)，在氧化應(yīng)激和聚集化情況下，α-Synuclein 可以被硝化。在帕金森患者的腦中檢測(cè)到有硝化的聚集化的α-Synuclein 出現(xiàn)，而且損傷的多巴胺能神經(jīng)元能夠釋放硝化的α-Synuclein 聚集體［25］。體外研究發(fā)現(xiàn)，重組的硝化的α-Synuclein 聚集體能夠刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子，改變小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，并通過小膠質(zhì)細(xì)胞最終對(duì)多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)毒性［26-27］。

2.2.3 突變的α-Synuclein 激活小膠質(zhì)細(xì)胞的研究 α-Synuclein 有3個(gè)與家族性帕金森病緊密聯(lián)系的錯(cuò)義突變:A53T 和A30P 及E46K。在體外的原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系中分別用單體形式的α-Synuclein 3 種突變體處理，結(jié)果顯示，與野生型的單體α-Synuclein 相比A30P 和E46K 引起小膠質(zhì)細(xì)胞釋放了更多了促炎因子。隨后的機(jī)制研究表明，這3 種突變體可能同過NADPH 的氧化以及與Mac-1 的結(jié)合發(fā)揮作用［22，28］。

2.2.4 α-Synuclein 基因敲除和過表達(dá)細(xì)胞體系研究 Austin 等人從α-Synuclein 基因敲除的小鼠中獲得的小膠質(zhì)細(xì)胞，在形態(tài)方面和正常的小膠質(zhì)細(xì)胞相比有很大的不同，被刺激活化后α-Synuclein 基因敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞和正常的小膠質(zhì)細(xì)胞相比釋放了更多的如TNF-α和IL-6 等促炎癥因子，但是與正常的小膠質(zhì)細(xì)胞相比，α-Synuclein 基因敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞展示了較弱的吞噬能力［29］。Wood 研究小組構(gòu)建了過表達(dá)野生型和過表達(dá)突變體A53T α-Synuclein 的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y 體系，并且在過表達(dá)細(xì)胞體系培養(yǎng)液中用蛋白電泳方法檢測(cè)到了α-Synuclein，接著他們用過表達(dá)體系的培養(yǎng)液處理小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞BV2，結(jié)果BV2 細(xì)胞的促炎因子如TNF-alpha 和IL-1alpha 及IL-1beta 的mRNA 水平與釋放都有顯著升高;而用MPTP 處理過表達(dá)體系后獲得的培養(yǎng)液刺激BV2 細(xì)胞，同樣觀察到炎癥反應(yīng)發(fā)生，但是直接用MPTP 處理BV2 細(xì)胞沒有觀察到炎癥反應(yīng)發(fā)生［30］。Combs 小組在BV2 細(xì)胞中過表達(dá)野生型和突變型的α-Synuclein，并用蛋白電泳、酶聯(lián)免疫技術(shù)觀察BV2 細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)α-Synuclein 的BV2 細(xì)胞TNF-α、IL-6、NO 的釋放量顯著升高了，但是與正常BV2 細(xì)胞相比過表達(dá)細(xì)胞體系具有較弱的吞噬能力［31］。

2.3 α-Synuclein 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活作用動(dòng)物模型水平研究 Standaert 等人在小鼠黑質(zhì)中過表達(dá)人源α-Synuclein，結(jié)果檢測(cè)到促炎因子和NF-κB 的亞單位p65 表達(dá)水平升高，而在FcγR敲除小鼠中這一現(xiàn)象明顯減弱。這提示NF-κB和FcγR 參與了由α-Synuclein 引發(fā)的炎癥反應(yīng)［32］。Mouradian 等人在轉(zhuǎn)基因小鼠模型中研究了α-Synuclein 的磷酸化對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響，研究發(fā)現(xiàn)磷酸化修飾的α-Synuclein 具有激活小膠質(zhì)細(xì)胞的能力，而用磷蛋白磷酸酶對(duì)α-Synuclein 進(jìn)行去磷酸化作用后，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活水平明顯降低［33］。

3 結(jié)語(yǔ)

小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活以及其引起的多巴胺能神經(jīng)元的損傷可能在帕金森病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。在帕金森病的發(fā)病過程中，異常聚集α-Synuclein 會(huì)在細(xì)胞之間擴(kuò)散，并且會(huì)被釋放到胞外環(huán)境中。這些胞外的α-Synuclein 可能同小膠質(zhì)細(xì)胞上的MAC1 受體結(jié)合激活小膠質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生氧自由基和細(xì)胞毒性因子，最終對(duì)多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生損傷?；谝陨涎芯?，干擾α-Synuclein 引起小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，將成為治療帕金森病的策略之一。

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