付鑫焱，盧蘊(yùn)容，2，吳娟利，吳雪艷，包愛(ài)民

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系、浙江省神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310058;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院精神科，浙江杭州 310009)

重性抑郁障礙(Major depressive disorder，MDD)是一種常見(jiàn)的情緒障礙，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，據(jù)統(tǒng)計(jì)MDD在浙江省發(fā)病率已達(dá)到4.3%［1］。MDD 的主要癥狀是長(zhǎng)期情緒低落、思維遲緩和行為遲鈍［2］。患者工作能力或行動(dòng)力喪失，自殺率高達(dá)15%，因此，給個(gè)人和社會(huì)造成巨大危害。在對(duì)MDD的發(fā)病機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元突觸傳遞過(guò)程中起信使作用的神經(jīng)遞質(zhì)的改變是重要的致病因素之一。在臨床上，這種改變可以體現(xiàn)為不同腦區(qū)、體液(包括腦脊液、血液和尿液)中神經(jīng)遞質(zhì)水平變化［3-4］。確定這些神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化特征與發(fā)病、治療以及疾病轉(zhuǎn)歸之間的關(guān)系，無(wú)疑對(duì)于抑郁癥的臨床診斷和相關(guān)發(fā)病機(jī)制研究具有重要意義。

氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)是一類(lèi)能夠通過(guò)神經(jīng)突觸傳遞神經(jīng)信息的氨基酸，其中谷氨酸(Glutamate，Glu)和天冬氨酸(Aspartic acid，Asp)是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid，GABA)和甘氨酸(Glycine，Gly)是抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［5-6］。大量的臨床和對(duì)于人腦材料的研究證實(shí)，氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)參與抑郁癥發(fā)病機(jī)制，例如谷氨酸能和GABA能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)調(diào)節(jié)失衡導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺軸活性亢進(jìn)［7-8］，而后者在抑郁癥癥狀和體征形成中扮演中心角色。關(guān)于A(yíng)sp和Gly在抑郁癥中的改變的研究報(bào)道則相對(duì)較少，結(jié)論也不一致。

Francis等人［9］報(bào)道了難治性抑郁癥患者額葉皮層中Asp濃度升高。Altamura等人［10］發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)治療的抑郁癥患者血漿Asp水平和對(duì)照組沒(méi)有差異，Gly水平顯著降低。Mauri等人［11］發(fā)現(xiàn)，非憂(yōu)郁型MDD患者血漿Asp和Gly水平與健康對(duì)照組相比無(wú)顯著差異;用藥物抗抑郁治療8周后，MDD患者血漿Asp和Gly水平與治療前相比也無(wú)顯著改變。Sumiyoshi等人［12］同樣報(bào)道了MDD患者血漿Gly水平無(wú)明顯改變。這些研究發(fā)現(xiàn)之間的差異性可能和樣本的抑郁癥亞型、治療干預(yù)方案等因素有關(guān)。因此，在進(jìn)行這類(lèi)研究中應(yīng)該特別注意對(duì)于抑郁癥亞型、治療干預(yù)的措施等條件的限定，以正確判斷氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)水平的相應(yīng)改變及其和臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)聯(lián)。

研究表明，血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)的存在使血漿和腦中氨基酸絕對(duì)水平之間存在差異。BBB的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)能夠?qū)⒀獫{氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)至大腦，同時(shí)能夠?qū)⒛X中神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)氨基酸(包括Asp和Gly)逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)至血液［13-15］。靜脈血和腦脊液內(nèi)氨基酸水平之間存在著相關(guān)性［16-17］。血漿氨基酸水平有可能間接反映腦內(nèi)氨基酸水平而成為MDD的臨床生物學(xué)指標(biāo)之一，但是這種相關(guān)性在抑郁癥中是否存在以及特征如何尚待研究。因此，本研究從新發(fā)病MDD抑郁癥亞型患者著手，研究血漿Asp和Gly水平在治療前后的改變。作為對(duì)照，還同時(shí)研究了血漿內(nèi)非神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸天冬酰胺(Asparagine，Asn)的水平。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象為2009年9月至2010年5月間浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院精神科住院及門(mén)診的首發(fā)MDD患者。MDD患者由浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院精神科專(zhuān)科醫(yī)師根據(jù)美國(guó)《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，F(xiàn)ourth Edition，DSM-IV)［18］診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷，同時(shí)進(jìn)行貝克抑郁問(wèn)卷(Beck Depression inventory，BDI)和漢密爾頓抑郁量表(Hamilton Depression Rating Scale，HAMD)評(píng)分［19］。排除標(biāo)準(zhǔn)為:1)器質(zhì)性精神障礙、精神活性物質(zhì)所致精神障礙、精神分裂癥;2)嚴(yán)重性軀體疾病;3)體重指數(shù)(Body Mass Index，BMI)異常 (BMI≤ 18或BMI≥25)。健康對(duì)照者來(lái)自同期在醫(yī)院進(jìn)行健康體檢人群，排除任何軀體疾病和精神障礙。15例MDD患者中男性9例、女性6例，平均年齡(47 ±10.7)歲，BECK 評(píng)分為(31.3 ±10.3)分，HAMD 評(píng)分為(34.0±10.9)分;14位健康對(duì)照者中男性7例、女性7例，平均年齡為(49±13.0)歲。其中7例MDD患者(男5例，女2例)在用氟西汀抗抑郁治療2月后進(jìn)行隨訪(fǎng)并收集血漿，HAMD評(píng)分為(14.0±4.2)分。所有患者和健康對(duì)照者均志愿加入研究并簽署知情同意書(shū)，本研究獲得浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集和處理 MDD患者和健康對(duì)照者分別于上午6∶00-9∶00空腹抽取靜脈血6 ml至抗凝管(含EDTA)中;4℃ 12 000 g離心15 min，取上清液分裝于1.5 ml離心管中，-20℃貯存，并在1個(gè)月內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80℃保存。樣品分析時(shí)取出樣品，冰上解凍;混勻，靜置20 min，4℃，12 000 g離心 20 min;取上清液至新離心管中，放于真空冷凍干燥儀中凍干，然后用60%乙醇溶解上樣。

1.2.2 氨基酸濃度測(cè)定 血漿氨基酸濃度測(cè)定采用高效液相色譜—熒光法(High performance liquid chromatography with fluorescence detection，HPLC-FLD)，HPLC 方法參考先前文獻(xiàn)并加以修改［21-22］。主要儀器與試劑:Agilent 1100高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent Technologies)，真空冷凍干燥儀(美國(guó)Labconco)。L-Asp、L-Asn、L-Gly標(biāo)品(美國(guó)Sigma公司)，鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPA，美國(guó) Pickering Laboratories公司)，甲醇(霍尼韋爾Burdick＆Jackson公司)，無(wú)水醋酸鈉(溫州潤(rùn)華化工實(shí)業(yè)有限公司)等。色譜條件:色譜柱:Venusil XBP-C18柱子(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相 A 相:醋酸鈉(20 mmol· L-1)-三乙胺(pH=7.0)-四氫呋喃-甲醇(體積比為1000∶0.18∶3∶100)，流動(dòng)相 B 相:醋酸鈉(20 mmol· L-1，pH=7.0)-甲醇(體積比為1∶4)。梯度洗脫程序:在不同時(shí)間段，流動(dòng)相B的體積占流動(dòng)相總體積(A相 +B相)的百分比分別為:0 ～10 min，90%;10～20 min，88%;20～30 min，50%;30～31 min，90%;31～41 min，90%;整個(gè)洗脫過(guò)程經(jīng)歷41 min。柱溫:35℃;流速:1.0 ml· min-1;進(jìn)樣量 1μL;熒光檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)450 nm。在選定的色譜條件下，經(jīng)過(guò)41 min洗脫，Asp、Asn和Gly的色譜峰分離較好(見(jiàn)圖1)。

2 結(jié)果

2.1 氨基酸水平 MDD患者血漿Asp水平(2.14±2.02)μmol· L-1顯著低于健康對(duì)照組(8.18 ±3.21)μmol· L-1，P ＜0.001。在對(duì)照組或者M(jìn)DD組內(nèi)，男性血漿Asp水平和女性相比無(wú)顯著差異(P≥0.478)。

MDD患者血漿 Gly水平(98.70±52.64)μmol· L-1顯著低于健康對(duì)照組(143.80±55.14)μmol· L-1，P=0.033。在對(duì)照組內(nèi)或者M(jìn)DD組內(nèi)，男性血漿Gly水平和女性相比均無(wú)顯著性差異(P≥0.722)。

MDD患者血漿 Asn水平(9.02±4.37)μmol· L-1和健康對(duì)照組(11.04 ±4.03)μmol· L-1相比無(wú)顯著差異(P=0.208)。在對(duì)照組內(nèi)或者M(jìn)DD組內(nèi)，男性血漿Asn水平和女性相比也無(wú)顯著差異(P≥0.397)。

2.2 相關(guān)性分析 在健康對(duì)照組，血漿Gly水平與 Asp水平顯著正相關(guān)(n=14，r=0.874，P＜0.001，見(jiàn)圖 2A)，Gly水平與 Asn 水平顯著正相關(guān)(n=14，r=0.720，P=0.004，見(jiàn)圖 2B)，Asp水平與Asn水平顯著正相關(guān)(n=14，r=0.763，P=0.001)。然而，MDD 患者血漿 Gly水平與Asp水平、Asp與Asn水平的相關(guān)性分別缺失(P≥0.538)，Gly水平與 Asn水平仍然保持顯著正相關(guān)(n=15，r=0.857，P ＜0.001，見(jiàn)圖2C)。

在健康對(duì)照和MDD患者中，血漿氨基酸水平與年齡(P≥0.147)無(wú)相關(guān)性，在新發(fā)MDD患者，血漿氨基酸水平與HAMD評(píng)分(P≥0.145)無(wú)顯著相關(guān)性。

2.3 抗抑郁治療后氨基酸水平 和治療前相比，MDD患者血漿Asp、Gly、Asn水平無(wú)顯著改變(P≥0.306)。Gly與 Asp水平、Asp與 Asn水平之間仍然無(wú)顯著相關(guān)性(P≥0.317)，而Gly水平與Asn水平的顯著正相關(guān)性仍然存在(n=7，r=0.980 ，P ＜0.001，見(jiàn)圖2D)。

3 討論

本次研究發(fā)現(xiàn)，新發(fā)MDD患者的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)Asp和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)Gly的血漿水平顯著低于健康對(duì)照組，非神經(jīng)遞質(zhì)Asn的血漿水平和對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。在健康對(duì)照組Gly與Asp水平，以及Asp和Asn水平之間分別顯著正相關(guān)，而在MDD患者這些相關(guān)性消失。MDD患者抗抑郁治療后在抑郁癥狀顯著改善狀態(tài)下，Asp、Gly和Asn水平無(wú)顯著改變，氨基酸水平之間的相關(guān)性也保持不變。

我們對(duì)于新發(fā)MDD患者興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)Asp的血漿水平顯著降低的報(bào)道尚屬首次。Altamura等人［10］曾經(jīng)報(bào)道未經(jīng)治療的抑郁癥患者血漿Asp水平和對(duì)照組相比沒(méi)有差異，我們注意到他們所研究的患者包含雙向抑郁癥患者。有報(bào)道雙向抑郁癥患者血漿氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平不同于 MDD患者［22］。Mauri等人［11］報(bào)道，MDD患者血漿Asp和Gly水平與健康對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，但是他們所研究的患者特指非憂(yōu)郁型MDD(major depression without melancholia)患者。這與我們所研究的病例也不同，我們的研究囊括了憂(yōu)郁型和非憂(yōu)郁型MDD。我們發(fā)現(xiàn)的血漿Gly水平降低和Altamura等人［10］的報(bào)道一致，但是 Sumiyoshi等人［12］曾經(jīng)報(bào)道MDD患者血漿Gly水平和正常對(duì)照組相比無(wú)差異。值得注意的是，他們所研究的病例至少有3個(gè)月沒(méi)有遵醫(yī)囑接受抗抑郁藥物治療，患者平均HAMD評(píng)分為23，抑郁程度明顯低于我們目前所研究的新發(fā)病MDD患者(HAMD評(píng)分平均值34)。上述這些研究之間的差異提示，在對(duì)于抑郁癥患者體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量進(jìn)行研究時(shí)，需要嚴(yán)格限定疾病類(lèi)型、病情程度、治療狀況等干擾因素。MDD患者血漿Asp和Gly水平降低的原因可能包括:(1)MDD患者對(duì)營(yíng)養(yǎng)的消化吸收能力降低，體內(nèi)氨基酸合成功能下降。Asp、Gly和Asn都屬于非必需氨基酸，體內(nèi)能夠自己合成。MDD患者食欲減退，飲食減少，活動(dòng)量下降，體內(nèi)新陳代謝率降低，因此，Asp、Gly和 Asn的合成可以降低。但是，非神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸Asn在血漿中水平保持不變的狀態(tài)則提示，神經(jīng)遞質(zhì)Asp和Gly血漿水平的改變并非單純由外周合成降低引起的。(2)BBB轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)功能改變。BBB的存在使外周氨基酸不能自由進(jìn)入中樞，血漿和腦中氨基酸濃度存在著差異［15］。血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上存在多種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)能夠?qū)⒀獫{中氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)至大腦，BBB決定了腦內(nèi)必需氨基酸的獲得和含量［15］。非必需氨基酸例如LAsp的轉(zhuǎn)運(yùn)速率和攝入量顯著低于必需氨基酸［15，23］，但是在慢性疾病條件下，這一從外周到中樞的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程則可能扮演重要角色。BBB還參與清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的過(guò)程［13］，星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元上存在轉(zhuǎn)運(yùn)中性氨基酸和酸性氨基酸的Na+依賴(lài)的轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)，能夠?qū)⒛X中神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)氨基酸，包括Asp和Gly，逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)至血液［13-15］。MDD患者血漿 Asp和 Gly水平降低可能是由于中樞神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)氨基酸水平降低而導(dǎo)致向外周轉(zhuǎn)運(yùn)減少，和/或BBB轉(zhuǎn)運(yùn)體功能改變而導(dǎo)致向外周轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸水平降低，加上外周氨基酸合成功能減低，共同導(dǎo)致血漿Asp和Gly水平低下。

在健康對(duì)照組中，血漿Asp、Gly和Asn水平之間的顯著相關(guān)性體現(xiàn)了它們?cè)诖x調(diào)節(jié)通路上的密切關(guān)聯(lián)。Asp是合成Asn的前體物質(zhì)［24］，Asn在天冬酰胺酶的催化下又可以轉(zhuǎn)化為Asp。另一方面，神經(jīng)遞質(zhì)Asp和Gly都是N-甲 基-D-天 冬 氨 酸 (N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體的天然配體［25］，Asp是其內(nèi)源性激動(dòng)劑，Gly是其必需的協(xié)同激動(dòng)劑［26-27］，Asp 和Gly之間動(dòng)態(tài)平衡的調(diào)節(jié)機(jī)制是生理狀態(tài)下NMDA受體功能維持正常的保證。在MDD患者中這些調(diào)節(jié)機(jī)制紊亂，可能是造成這些神經(jīng)遞質(zhì)之間相關(guān)性喪失的主要原因。MDD患者Gly水平與Asn水平之間的顯著正相關(guān)性在治療前后均未發(fā)生改變，這其中的生物學(xué)意義值得進(jìn)一步研究。這種存在于MDD的神經(jīng)遞質(zhì)和非神經(jīng)遞質(zhì)類(lèi)氨基酸之間的密切關(guān)聯(lián)，為我們了解MDD中NMDA受體調(diào)節(jié)狀態(tài)提供了有益的線(xiàn)索。此外，外周非神經(jīng)組織，例如骨骼、胰腺、心臟、肺臟、肝臟、腸道等處也發(fā)現(xiàn)存在著谷氨酸受體，人們推測(cè)谷氨酸可能類(lèi)似于分布更為廣泛的“細(xì)胞因子”，對(duì)不同組織的細(xì)胞功能產(chǎn)生影響［28］。因此，抑郁癥患者血漿氨基酸水平的改變也為其外周臟器功能改變提供了一種可能的原因，其具體作用機(jī)制和結(jié)果有待進(jìn)一步研究。

本次研究發(fā)現(xiàn)，MDD患者血漿Asp和Gly及Asn水平在抗抑郁治療前后無(wú)顯著變化，這與前人采用藥物治療MDD患者的觀(guān)察報(bào)道一致［11］。值得注意的是，Palmio 等人［29］發(fā)現(xiàn)電休克療法(Electroconvulsive therapy，ECT)對(duì)Gly水平無(wú)顯著影響，但是引起MDD患者血漿Asp和Asn水平顯著升高。有報(bào)道稱(chēng)ECT能夠顯著改變BBB的通透性［30］。這再次顯示不同的治療方案可以顯著影響體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。因此，在進(jìn)行對(duì)比研究時(shí)要仔細(xì)匹配相關(guān)干擾因素，在分析結(jié)論時(shí)要對(duì)相關(guān)干擾因素加以甄別。由于在氟西汀抗抑郁治療之后，在抑郁癥狀改善的條件下，MDD患者Asp和Gly及Asn水平?jīng)]有顯著改變，而氨基酸水平之間的相關(guān)性也保持不變。有理由推測(cè)這提示了血漿Asp和Gly低水平狀態(tài)可能是MDD的特征性而不是階段性生物學(xué)指標(biāo)，應(yīng)該在擁有更大規(guī)模臨床樣本量的條件下對(duì)此加以確認(rèn)，并進(jìn)一步和其他抑郁癥亞型進(jìn)行對(duì)比。

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