孫 博，高尚鋒，阮玲娟，包愛民

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系、浙江省神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310058)

下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamo-pituitary-adrenal axis，HPA)軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分，參與調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)。下丘腦室旁核(paraventricularnucleus，PVN)分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone，CRH)作用于垂體，垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)作用于腎上腺皮質(zhì)，腎上腺皮質(zhì)分泌的糖皮質(zhì)激素(大鼠中為皮質(zhì)酮)介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)。此外，腎上腺皮質(zhì)激素還可以作用于大腦前額葉皮層、海馬、下丘腦等部位，對(duì)HPA軸進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)。HPA軸活性亢進(jìn)，尤其是其活性的中樞性驅(qū)動(dòng)因子CRH神經(jīng)元的過(guò)度激活，是抑郁癥發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素［1-4］。我們的前期研究表明，人體下丘腦PVN內(nèi)CRH神經(jīng)元活性存在著明顯性別差異，并且與外周性激素水平相關(guān)，這一生理現(xiàn)象可能是抑郁癥發(fā)病中性別差異的基礎(chǔ)［5］。

性激素是甾體激素，可以直接進(jìn)入細(xì)胞通過(guò)與其核受體結(jié)合調(diào)節(jié)目的基因轉(zhuǎn)錄。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，雄激素(核)受體(androgen receptor，AR)和雌激素(核)受體(estrogen receptor，ER)及下丘腦PVN內(nèi)CRH神經(jīng)元均分別存在著共定位［6-7］，雄激素與AR結(jié)合后可以抑制CRH基因表達(dá)，減低HPA軸活性;雌激素和ER結(jié)合后可刺激CRH基因表達(dá)，提高HPA軸活性［6-7］。抑郁癥患者下丘腦PVN內(nèi)CRH神經(jīng)元活性增高伴隨ER基因表達(dá)上調(diào)和AR基因表達(dá)下調(diào)［6］。這些研究提示，性激素及其受體在抑郁癥中直接參與HPA軸活性的調(diào)節(jié)。

早期生活壓力(又稱童年逆境)，例如兒童期遭受虐待、忽視等，可能造成HPA軸活性的持續(xù)性改變［4］，增加其成年期應(yīng)激敏感性以及罹患抑郁癥的易感性［8］。然而，這種影響存在著性別差異。經(jīng)歷過(guò)早期生活壓力的女性成年后罹患抑郁癥的風(fēng)險(xiǎn)更大［9］。大鼠母愛剝奪模型通過(guò)將剛出生的仔鼠與母鼠短暫隔離，模擬由于母愛缺乏造成的早期生活壓力，是研究這一類疾病的良好動(dòng)物模型。已有報(bào)道顯示，雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠在母愛剝奪后HPA軸活性升高［10］。但是，迄今為止尚缺乏對(duì)于雌性SD大鼠母愛剝奪模型的研究的報(bào)道。由于抑郁癥的發(fā)病和早期生活壓力均與HPA軸活性密切相關(guān)，并都存在性別差異，而臨床上女性重型抑郁障礙的發(fā)病率是男性的兩倍［4］，因此，研究雌性大鼠母愛剝奪模型的特征具有重要意義。在本研究中我們建立雌性大鼠母愛剝奪模型，探討母愛剝奪的雌鼠在成年期HPA軸活性和應(yīng)激反應(yīng)特征。

1 材料與方法

1.1 母愛剝奪模型建立 母鼠選擇正常成年SD大鼠(清潔級(jí))，體重220～250 g。根據(jù)已報(bào)道的雄鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮炷＃?0］:母鼠生產(chǎn)仔鼠的當(dāng)日定義為P0，仔鼠出生后選擇雌性仔鼠進(jìn)行研究。出生后第1天(P1)將出生自同一孕鼠的雌性仔鼠隨機(jī)分為母愛剝奪組(n=24)和對(duì)照組(n=26)。對(duì)于母愛剝奪組，出生后第2～5天(P2—P5)，每日將仔鼠與母鼠分離4 h，第6～20天(P6—P20)，每日分離6 h。對(duì)照組仔鼠和母鼠始終共同生活，不做任何特殊處理。第21天，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組仔鼠同時(shí)斷奶，移入標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物恒溫恒濕飼養(yǎng)環(huán)境，自由飲食，日夜循環(huán)為12 h/12 h。

1.2 急性應(yīng)激 在雌鼠成年后(P100)，通過(guò)每日上午9∶00-10∶00陰道涂片，連續(xù)觀察兩個(gè)完整動(dòng)情周期。分別選擇處于動(dòng)情前期和動(dòng)情期的雌鼠進(jìn)行直接取材或急性應(yīng)激后取材。急性應(yīng)激為輕微足底電擊，使用0.8 mA電流每間隔25 s給予5 s電擊，連續(xù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，共計(jì)15 min。在兩個(gè)動(dòng)情周期的階段(動(dòng)情前期、動(dòng)情期)分別建立4組:母愛剝奪急性應(yīng)激組、母愛剝奪非急性應(yīng)激組、非母愛剝奪急性應(yīng)激組和非母愛剝奪非急性應(yīng)激組，每組6～7只大鼠。

1.3 取材 于上午9∶00-11∶00完成對(duì)非急性應(yīng)激組取材之后再完成對(duì)急性應(yīng)激組的足底電擊。電擊結(jié)束后立即斷頭。使用EDTA抗凝管留取軀干血，溫和混勻后，4℃條件下1500 r/min離心20 min，取上層血漿，分裝后保存于-80℃冰箱。于冰上快速取出整腦，并置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定24 h，之后在20%和30%蔗糖溶液中分別脫水24 h，最終保存在4℃的30%蔗糖溶液中。所有標(biāo)本保存到相關(guān)檢測(cè)開始時(shí)取出。

1.4 激素水平測(cè)定 采用放射免疫法測(cè)定血漿雌二醇(DSL公司)、睪酮(Immotech公司)、ACTH(Cisbio公司)水平。雌二醇的組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為8.9%和12.2%，睪酮的組內(nèi)和組間變異系數(shù)為8.6%和11.9%，ACTH組內(nèi)和組間的變異系數(shù)分別為10.2%和2.2%。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血漿皮質(zhì)酮(IBL公司)水平，組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為4.0%和 6.2%。

1.5 PVN內(nèi)ER-β和AR免疫組化染色 使用冰凍切片常規(guī)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)下丘腦PVN中ER-β和AR的表達(dá)。AR抗體來(lái)自BD公司(1∶400稀釋)，ER-β抗體來(lái)自 Abcam公司(1∶200稀釋)，均為4℃孵育過(guò)夜，兩種抗體均為兔來(lái)源的多克隆抗體。二抗為山羊抗兔血清(中彬金橋公司，不稀釋直接使用，室溫1 h)，顯色劑為 DAB(Sigma公司)。步驟中，所有除特殊標(biāo)注外，稀釋液和洗滌液均為Tris-HCl緩沖液(TBS 溶液，0.05 mol/L，pH=7.6)。使用 Image Pro Plus 6.2(Media Cybernetics，Bethesda，USA)軟件進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)圖像分析。計(jì)數(shù)細(xì)胞時(shí)，在高倍鏡下(40倍物鏡)隨機(jī)選取下丘腦PVN內(nèi)5個(gè)100 μm×100 μm的視野，對(duì)每個(gè)視野中陽(yáng)性染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，平均后作為計(jì)數(shù)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 正常成年雌鼠血漿性激素水平 未經(jīng)過(guò)母愛剝奪和足底電擊的成年雌鼠在不同動(dòng)情周期血漿性激素水平的變化如圖1顯示。與動(dòng)情前期相比，血漿中雌二醇(A)和睪酮(B)水平在動(dòng)情期和動(dòng)情間期都顯著下降(P＜0.001)，但二者在動(dòng)情期和動(dòng)情間期之間均沒有顯著差異。

2.2 血漿ACTH水平 正常對(duì)照組成年雌性大鼠血漿ACTH水平在動(dòng)情前期和動(dòng)情期之間沒有明顯差異。母愛剝奪導(dǎo)致血漿中基礎(chǔ)ACTH水平明顯下降 (圖2A，P=0.012)，但對(duì)足底電擊引起的ACTH水平變化無(wú)顯著影響。母愛剝奪引起的ACTH降低主要出現(xiàn)在動(dòng)情前期(圖2B，P=0.047)而不是動(dòng)情期。足底電擊在母愛剝奪和非剝奪雌鼠中均引起血漿中ACTH濃度顯著升高(圖2，P ＜0.0001)，這種應(yīng)激反應(yīng)與大鼠的動(dòng)情周期無(wú)關(guān)。

2.3 血漿皮質(zhì)酮水平 正常對(duì)照組成年雌性大鼠血漿皮質(zhì)酮水平在動(dòng)情前期和動(dòng)情期之間沒有明顯差異。母愛剝奪引起的皮質(zhì)酮水平在動(dòng)情前期和動(dòng)情期均有降低的趨勢(shì)。足底電擊在母愛剝奪和非剝奪雌鼠中均引起血漿中皮質(zhì)酮濃度顯著升高(圖3，P＜0.05)，動(dòng)情前期對(duì)照組和母愛剝奪組雌鼠都比動(dòng)情期雌鼠對(duì)足底電擊更為敏感(圖3B、C，P ＜0.01)。母愛剝奪導(dǎo)致血漿中基礎(chǔ)皮質(zhì)酮水平明顯下降 (圖3A，P=0.019)，但對(duì)足底電擊引起的皮質(zhì)酮水平變化無(wú)顯著影響。

2.4 下丘腦PVN內(nèi)AR和ER表達(dá) AR和ER-β廣泛分布與下丘腦區(qū)域，但在PVN中的染色輪廓明顯(圖4A、B)。AR主要表達(dá)在細(xì)胞核(圖4a)，ER-β在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有染色(圖4b)。母愛剝奪顯著降低成年雌鼠下丘腦 PVN中 AR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(圖 5，P=0.008)，這種影響主要表現(xiàn)在動(dòng)情期。急性足底電擊沒有導(dǎo)致母愛剝奪鼠和非剝奪鼠下丘腦PVN中AR表達(dá)的改變。母愛剝奪和/或足底應(yīng)激對(duì)下丘腦PVN中ER-β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均無(wú)顯著影響。

3 討論

本次研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷母愛剝奪的雌性SD大鼠成年后血漿基礎(chǔ)ACTH和皮質(zhì)酮水平明顯下降。母愛剝奪引起的血漿ACTH基礎(chǔ)水平降低主要表現(xiàn)在動(dòng)情前期，而皮質(zhì)酮水平的降低同時(shí)表現(xiàn)在動(dòng)情前期和動(dòng)情期。急性應(yīng)激(足底電擊)在母愛剝奪和非剝奪雌性SD大鼠中均引起血漿中ACTH和皮質(zhì)酮濃度顯著升高。這與前人應(yīng)用其它急性應(yīng)激模型得到的結(jié)果相符［10］，同時(shí)也說(shuō)明成年后的急性應(yīng)激并不能使母愛剝奪雌鼠的HPA軸活性敏化。下丘腦PVN內(nèi)ER-β陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在雌鼠母愛剝奪和急性應(yīng)激后無(wú)顯著改變，但是AR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在母愛剝奪后顯著降低。這說(shuō)明AR表達(dá)明顯受到母愛剝奪的影響，并參與調(diào)節(jié)HPA軸活性。

成年健康雌性SD大鼠在動(dòng)情周期的不同階段血漿性激素水平存在明顯波動(dòng)，從動(dòng)情前期向動(dòng)情期過(guò)渡中雌二醇和睪酮水平均顯著降低，而在動(dòng)情期和動(dòng)情間期之間這些激素水平波動(dòng)并不顯著。因此，我們選擇連續(xù)的兩個(gè)階段(動(dòng)情前期和動(dòng)情期)，對(duì)經(jīng)受過(guò)早期母愛剝奪的雌鼠進(jìn)行HPA軸活性及其在急性應(yīng)激反應(yīng)中的變化的研究。在動(dòng)情前期血漿中性激素的水平最高，因此，動(dòng)情前期ACTH的水平改變提示其更依賴于性激素對(duì)于HPA軸功能的調(diào)節(jié)。在血漿性激素高水平的動(dòng)情前期和血漿性激素水平下降的動(dòng)情期，皮質(zhì)酮水平均發(fā)生改變，提示皮質(zhì)酮水平受到性激素之外的其它因素的調(diào)節(jié)。

Nemeroff等［10］在使用雄性SD大鼠進(jìn)行母愛剝奪實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷母愛剝奪的雄鼠成年后HPA軸基礎(chǔ)活性上升，表現(xiàn)為下丘腦正中隆起處CRH濃度增加和血清ACTH水平升高［10］。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)歷相同母愛剝奪過(guò)程的SD雌鼠的HPA軸基礎(chǔ)活性降低，表現(xiàn)為血漿ACTH和皮質(zhì)酮水平下降。這提示母愛剝奪模型的HPA軸活性存在著性別差異。在其他母愛剝奪模型和其他品系的大鼠中，也存在類似的性別差異。例如在Long-Evans大鼠中，母愛剝奪只對(duì)雌鼠造成影響［11］，而在單次長(zhǎng)時(shí)間母愛剝奪模型中，雄性Wistar大鼠的抑郁樣反應(yīng)的易感性更高［12］。這種性別差異提示，在進(jìn)行對(duì)于動(dòng)物母愛剝奪效應(yīng)的研究中，要注意甄別動(dòng)物品系和性別差異，所得出的研究結(jié)論要注意限定動(dòng)物品系和性別范疇。

SD雌性大鼠母愛剝奪后的HPA軸活性“降低”也提示該模型中的母愛剝奪很有可能引發(fā)了雌鼠的類似創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(Posttraumatic Stress Disorder，PTSD)反 應(yīng)。PTSD是人類的早期生活壓力或生活中創(chuàng)傷性經(jīng)歷造成的精神疾病之一［8］。PTSD的典型表現(xiàn)之一就是HPA軸活性減低［13］，這與本研究的研究結(jié)果相符。PTSD患者海馬功能紊亂，糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體的敏感性增強(qiáng)，使得HPA軸負(fù)反饋增強(qiáng)，最終使患者基礎(chǔ)HPA 軸活性減低［13］。

本研究發(fā)現(xiàn)母愛剝奪引起雌性SD大鼠下丘腦PVN內(nèi)AR表達(dá)下調(diào)，而AR對(duì)CRH神經(jīng)元活性具有直接抑制作用［6］，因此，這種“去抑制”狀態(tài)引起的HPA軸活性“增加”，可能表現(xiàn)于PVN內(nèi)向腦干自主神經(jīng)系統(tǒng)投射而不是經(jīng)典地向垂體分泌的CRH增加。向腦干自主神經(jīng)系統(tǒng)投射的CRH的效應(yīng)是通過(guò)該系統(tǒng)增加腎上腺皮質(zhì)對(duì)于ACTH的敏感性而產(chǎn)生的［14］。這符合本研究所發(fā)現(xiàn)的SD雌性大鼠母愛剝奪模型具有類似于PTSD患者的皮質(zhì)激素受體敏感性增強(qiáng)，HPA軸負(fù)反饋增強(qiáng)而最終導(dǎo)致ACTH、皮質(zhì)酮等基礎(chǔ)水平減低現(xiàn)象。因此，可以推測(cè)母愛剝奪可能至少通過(guò)兩條通路影響神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng):一條通過(guò)下調(diào)PVN中AR的表達(dá)而“增加”HPA軸基礎(chǔ)活性［6］;另一條通過(guò)增加糖皮質(zhì)激素受體的敏感性而“減低”HPA軸基礎(chǔ)活性［13］，其最終結(jié)果都是導(dǎo)致動(dòng)物在成年后HPA軸基礎(chǔ)活性和應(yīng)激反應(yīng)的易感性改變。值得注意的是，這兩條通路調(diào)節(jié)的最終結(jié)果可能具有動(dòng)物品系差異和性別差異，研究時(shí)需要進(jìn)行甄別。

本研究建立的雌性SD大鼠母愛剝奪模型，為研究生活早期不良應(yīng)激對(duì)成年后應(yīng)激反應(yīng)和/或抑郁癥等疾病的易感性及其性別差異機(jī)制提供了有益的研究工具。母愛剝奪可以使雌性SD大鼠HPA軸基礎(chǔ)活性降低，該變化與外周性激素水平波動(dòng)相關(guān)聯(lián)。下丘腦內(nèi)雄激素比雌激素對(duì)于CRH活性的調(diào)節(jié)作用可能更為顯著。

［1］BANKI C M，KARMACS L，BISSETTE G，et al.Cerebrospinal fluid neuropeptides in mood disorder and dementia［J］.J Affect Disord，1992，25(1):39-45.

［2］RAADSHER F C，VANHEERIKHUIZE J J，LUCASSEN P J，et al.Corticotropin-releasing hormone mRNA levels in the paraventricular nucleus of patients with Alzheimer's disease and depression ［J］.Am J Psychiatry，1995，152(9):1372-1376.

［3］GAO S F，BAO A M.Corticotropin-Releasing Hormone，Glutamate，and γ-Aminobutyric Acid in Depression ［J］.Neuroscientist，2011，17(1):124-144.

［4］BAO A M，MEYNEN G，SWAAB D F.The stress system in depression and neurodegeneration:Focus on the human hypothalamus［J］.Brain Res Rev，2008，57(2):531-553.

［5］BAO A M，SWAAB D F.Gender difference in agerelated number of corticotropin-releasing hormoneexpressing neurons in the human hypothalamic paraventricular nucleus and the role of sex hormones［J］.Neuroendocrinology，2007，85(1):27-36.

［6］BAO A M，F(xiàn)ISCHER D F，WU Y H，et al.A direct androgenic involvement in the expression of human corticotropin-releasing hormone ［J］. Mol Psychiatry，2006，11(6):567-576.

［7］BAO A M，HESTIANTORO A，VAN SOMEREN E J W，et al.Colocalization of corticotropin-releasing hormone and oestrogen receptor-α in the paraventricular nucleus of the hypothalamus in mood disorders［J］.Brain，2005，128(6):1301-1313.

［8］GUTMAN D A，NEMEROFF C B.Persistent central nervous system effects of an adverse early environment:clinical and preclinical studies［J］.Physiol Behav，2003，79(3):471-478.

［9］MacMILLAN H L，F(xiàn)LEMING J E，STREINER D L，et al.Childhood abuse and lifetime psychopathology in a community sample ［J］.Am J Psychiatry，2001，158(11):1878-1883.

［10］LADD C O，OWENS M J，NEMEROFF C B.Persistent changes in corticotropin-releasing factor neuronal systems induced by maternal deprivation［J］.Endocrinology，1996，137(4):1212-1218.

［11］MOURLON V，BAUDIN A，BLANC O，et al.Maternal deprivation induces depressive-like behaviours only in female rats［J］.Behav BrainRes，2010，213(2):278-287.

［12］VIVEROS M P， LLORENTE R， LOPEZGALLARDO M，et al.Sex-dependent alterations in response to maternal deprivation in rats ［J］.Psychoneuroendocrinology，2009，34(Supplement 1):S217-S226.

［13］SECKL J R，MEANEY M J.Glucocorticoid“Programming”and PTSD Risk［J］.Ann N Y Acad Sci，2006，1071(1):351-378.

［14］BUIJS R M，KALSBEEK A.Hypothalamic integration of central and peripheral clocks［J］.Nat Rev Neurosci，2001，2(7)，521-526.