黃麗麗 王文軍 李瑞岐 歐陽能勇 楊冬梓

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院生殖中心，廣東廣州 510120

卵巢組織冷凍可以為卵巢早衰或癌癥需要放化療的患者提供恢復(fù)生育能力及內(nèi)分泌功能的可能性[1]。玻璃化冷凍是近年來出現(xiàn)的一種新的冷凍方法，該技術(shù)將冷凍對象直接投入液氮中快速降溫，避免冰晶形成，可以繞開組織內(nèi)不同細(xì)胞成分對慢速冷凍參數(shù)要求不同的技術(shù)障礙，從而提高冷凍保存效果。玻璃化冷凍的降溫速度直接決定冷凍保護(hù)劑能否形成玻璃態(tài)，而使用的載體是影響降溫速度的最重要因素。雖然目前應(yīng)用玻璃化方法凍存人卵巢組織已有陸續(xù)報道，其中采用的載體包括冷凍管[2]、開放式麥管[3]、最小微滴法[4]以及不銹鋼網(wǎng)篩[5]等，然而究竟何種載體更適合人卵巢組織玻璃化冷凍，需進(jìn)一步研究。固相表面玻璃化技術(shù)（solid-surface vitrification，SSV）是近年新出現(xiàn)的一種簡便有效的玻璃化方法，筆者前期曾成功將其用于玻璃化冷凍人卵巢組織片，并取得了與慢速程序化冷凍相當(dāng)?shù)男Ч鸞6]。本研究的目的是比較固相表面玻璃化冷凍和其他載體相比，對人卵巢組織玻璃化冷凍的效果。

1 材料與方法

1.1 人卵巢組織標(biāo)本的收集與預(yù)處理

卵巢標(biāo)本取自2011年11月～2012年6月就診于中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院婦產(chǎn)科、需經(jīng)腹或行腹腔鏡手術(shù)的16例患者，年齡 21～40 歲，平均（32.7±5.9）歲；有規(guī)律的月經(jīng)史，無內(nèi)分泌紊亂，無放化療史，半年內(nèi)無激素服用史，且卵巢囊腫直徑＜7 cm。其中，良性卵巢囊腫8例，子宮肌瘤5例，宮頸癌3例。所有患者均簽署知情同意書，本研究得到了中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

新鮮卵巢組織浸泡于含10%人血白蛋白+青鏈雙抗的L-15培養(yǎng)液（Gibco公司）中，于體式顯微鏡下去除多余髓質(zhì)后，切成約5 mm×1 mm×1 mm大小的皮質(zhì)小條，隨機(jī)分配到不同的實(shí)驗(yàn)組：新鮮組（F組）、冷凍管玻璃化組（TV組）、最小微滴玻璃化組（MDS組）、不銹鋼網(wǎng)篩玻璃化組（SLV組）和固相表面玻璃化組（SSV組）。新鮮組直接以4%多聚甲醛液固定。

1.2 玻璃化冷凍和復(fù)蘇過程

采用含有20%乙二醇（ethylene glycol，EG）+20%二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）的L-15溶液為玻璃化冷凍液。將卵巢組織依次浸泡于4℃25%、50%、75%和100%濃度的玻璃化冷凍液中逐步導(dǎo)入冷凍保護(hù)劑后，采用不同載體行玻璃化冷凍：①TV組將卵巢置于含有1 mL 4℃100%玻璃化冷凍液的無菌冷凍管中投入液氮；②MDS組用無菌的巴氏管將卵巢組織直接滴入液氮中；③SLV組將卵巢組織置不銹鋼網(wǎng)篩上投入液氮中；④SSV組將卵巢組織置于已在液氮中預(yù)冷的鋁箔上投入液氮中，在液氮面之下將卵巢組織收集入冷凍管中液氮保存。

復(fù)蘇時將冷凍管從液氮中取出，靜置10 s，除TV組將冷凍管置于37℃水浴中2～3 min取出卵巢組織外，MDS組、SLV組和SSV組打開冷凍管取出卵巢組織，將其依次轉(zhuǎn)移到0.5、0.25和0.125 mol/L蔗糖溶液中，洗滌后于37℃培養(yǎng)箱中靜置備用。

1.3 人卵巢皮質(zhì)片的體外培養(yǎng)

卵巢組織體外培養(yǎng)體系參考文獻(xiàn)[7]。將復(fù)蘇的卵巢組織置于嵌入式培養(yǎng)皿Millicell-ORG（Millipore公司）上培養(yǎng)。培養(yǎng)液成分：α-MEM液，2.5%人白蛋白，1%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白亞硒酸鈉ITS（含有胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白和亞硒酸鈉），500 mIU/mL重組人促卵泡生成素（rhFSH）以及青鏈雙抗。培養(yǎng)10 d，每2天更換新鮮培養(yǎng)液，吸出的培養(yǎng)液用于激素測定。培養(yǎng)結(jié)束后所有的卵巢組織用于組織學(xué)檢測。

1.4 組織學(xué)分析

卵巢組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后4 μm連續(xù)切片，行HE染色，每10個切片在光鏡下觀察計數(shù)一次。原始卵泡和初級卵泡計數(shù)以卵母細(xì)胞核作為標(biāo)記，盲法計數(shù)每個標(biāo)本中形態(tài)正常的原始卵泡和初級卵泡。參照Gougeon標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行卵泡分級和卵泡形態(tài)評價。

1.5 雌孕激素的測定

將更換的培養(yǎng)液收集于無菌EP管中，置于-20℃冰箱保存，培養(yǎng)結(jié)束后統(tǒng)一采用美國全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)ACS：180SE測定雌孕激素水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 11.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用單因素方差分析和χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析組織學(xué)結(jié)果，對培養(yǎng)液中雌二醇和孕酮的測定采用GLM中重復(fù)測量的方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢皮質(zhì)組織學(xué)分析結(jié)果

冷凍前后的組織切片在光鏡下均可見到形態(tài)正常和閉鎖的卵泡（圖1）。凍融后各組卵巢組織中卵泡形態(tài)正常率低于F組（P＜0.05）。其中，SSV組原始和初級卵泡正常形態(tài)率最高（P＜0.05），其次為MDS組和SLV組，后兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），TV組卵泡正常形態(tài)率最低（P＜0.05）（表1）。

圖1 凍融前后卵巢組織中不同級別的卵泡HE染色（×400）

表1 新鮮組和四組凍融后卵巢組織中原始和初級卵泡的平均正常形態(tài)率（±s，%）

表1 新鮮組和四組凍融后卵巢組織中原始和初級卵泡的平均正常形態(tài)率（±s，%）

注：F組為新鮮組；TV組為冷凍管組；MDS組為最小微滴組；SLV組為不銹鋼網(wǎng)篩組；SSV組為固相表面玻璃化組；與F組比較，*P＜0.05；與TV組比較，#P＜0.05；與 SSV組比較，▲P＜0.05

組別 原始卵泡 初級卵泡F組TV組MDS組SLV組SSV組90.27±6.02 64.57±11.84*78.36±7.62*#▲77.21±6.51*#▲84.70±5.03*83.56±7.99 59.95±15.27*72.34±9.72*#▲71.60±9.53*#▲79.75±6.54*

2.2 卵巢組織的體外培養(yǎng)

經(jīng)過體外10 d培養(yǎng)后，各組卵巢皮質(zhì)的邊緣變圓滑。光鏡下各組卵巢皮質(zhì)培養(yǎng)后均可見到存活卵泡，見圖2。如圖2所示，與新鮮未培養(yǎng)卵巢組織相比，培養(yǎng)后的各組卵巢組織中原始卵泡所占的比例均下降（P＜0.05），生長卵泡（包括初級和次級卵泡）比例均上升（P＜0.05）。新鮮未培養(yǎng)組原始卵泡和生長卵泡的比例分別為85.96%和14.04%；TV組培養(yǎng)后為60.66%和33.34%；MDS組培養(yǎng)后為 56.24%和43.76%；SLV組培養(yǎng)后分別為54.79%和45.21%；SSV組培養(yǎng)后為46.0%和54.0%。SSV組凍融組織體外培養(yǎng)后初級卵泡比例明顯高于其他冷凍組（P＜0.05），同時原始卵泡所占比例明顯低于其他冷凍組（P＜0.05）。TV組培養(yǎng)后兩類卵泡比例與其他各組之間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），培養(yǎng)后MDS組和SLV組的兩級卵泡所占比例組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 新鮮組和培養(yǎng)后各玻璃化組卵巢組織中原始卵泡和初級卵泡所占比例

2.3 培養(yǎng)液中激素的測定結(jié)果

體外培養(yǎng)的10 d中，與新鮮培養(yǎng)液相比，復(fù)蘇后卵巢組織培養(yǎng)液中雌二醇和孕酮的平均水平隨著培養(yǎng)時間逐漸升高（圖3A、3B）。SSV組雌二醇和孕酮平均濃度明顯高于其他組（P＜0.05）。TV組的兩種激素水平均顯著低于其他各組（P＜0.05）。MDS組與SLV組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 各玻璃化組卵巢組織體外培養(yǎng)液中雌二醇（A）和孕酮（B）的濃度

3 討論

玻璃化冷凍過程需要一個特殊的載體承載冷凍保護(hù)液和組織細(xì)胞，對于卵巢組織而言，載體需要一定的容積同時要盡量減少所需冷凍液的體積以提高降溫速度。此外，當(dāng)組織被浸入液氮中時，沸騰的氮?dú)獍诮M織周圍，由于其低導(dǎo)熱性形成有效的絕熱區(qū)從而減緩了降溫速度[9]。由此可見，載體的選擇要考慮上述多種影響因素。目前已有多種載體被實(shí)驗(yàn)性地應(yīng)用于玻璃化冷凍過程，如冷凍管（cryovial）、開放式拉長麥管[10]、最小微滴法和不銹鋼網(wǎng)篩等。

冷凍管被應(yīng)用于卵巢組織的程序化冷凍，但因管壁較厚和所需較多冷凍液，導(dǎo)致降溫速度慢，不能滿足玻璃化形成的需要。在本研究中，冷凍管玻璃化組的正常形態(tài)原始卵泡僅為64.57%，凍存效果顯著低于其他組。Yeoman等[4]使用直接微滴法玻璃化冷凍猴子的卵巢組織，復(fù)溫后約70.4%的卵泡保存正常形態(tài)。本研究中也使用了該方法玻璃化冷凍人卵巢組織，復(fù)溫后形態(tài)學(xué)檢測可見約78.36%的原始卵泡保存了正常形態(tài)，低于新鮮組和SSV組；體外培養(yǎng)后，生長卵泡比例增加，但仍低于新鮮組和SSV組，提示直接微滴玻璃化對卵巢組織中原始卵泡的形態(tài)及發(fā)育潛能存在一定影響。

固相表面玻璃化法是近年新出現(xiàn)的一種有效、簡便的玻璃化技術(shù)，曾成功用于玻璃化冷凍牛成熟卵母細(xì)胞[11]和羊卵巢組織[12]。與前述各載體相比，SSV法具有其獨(dú)特的優(yōu)勢：首先，由于該方案是直接將組織置于已經(jīng)在液氮中半懸預(yù)冷至-150～-180℃的固相表面，因而可以避免液氮蒸發(fā)產(chǎn)生氣泡導(dǎo)致的熱傳導(dǎo)阻滯[13]；其次，SSV技術(shù)與液氮接觸的相對面積更大，而且可以將冷凍組織所需的冷凍保護(hù)劑減至最少，從而提高降溫速度，促進(jìn)玻璃化的形成[12]。第三，應(yīng)用此方法可以冷凍較大體積的卵巢組織，能在較短時間內(nèi)完成大量卵巢皮質(zhì)的冷凍保存。第四，在SSV方法中，因直接將載有組織的玻璃態(tài)微滴浸入37℃復(fù)溫溶液中，可以很快復(fù)溫，避免冰晶再形成的發(fā)生從而減少對組織細(xì)胞的損傷。目前在SSV方法中使用的預(yù)冷的固相表面材料多報道為鋁箔，主要原因是鋁箔兼具優(yōu)良的導(dǎo)熱性和延展性，且價格便宜，便于操作。

筆者曾率先將SSV技術(shù)用于保存人卵巢組織，并證實(shí)其冷凍效果與傳統(tǒng)的程序化冷凍效果相當(dāng)。在本研究中，進(jìn)一步將SSV與其他載體（冷凍管、最小微滴法和不銹鋼網(wǎng)篩）相比，探討對解凍后卵巢組織中卵泡形態(tài)和體外生長能力及激素分泌功能的影響。結(jié)果顯示，解凍后，SSV組約有84.70%的原始卵泡維持了正常的形態(tài)，雖稍低于新鮮卵巢組織正常形態(tài)率（約90.27%），但與其他文獻(xiàn)報道的冷凍后70%～90%的原始卵泡正常形態(tài)率大致相當(dāng)[14-15]。凍融的卵巢組織培養(yǎng)后原始卵泡比例比新鮮未培養(yǎng)組降低，生長卵泡比例增加。SSV組生長卵泡比例明顯高于其他玻璃化組，培養(yǎng)液中雌二醇和孕酮平均濃度亦高于其他玻璃化組。由此證實(shí)SSV技術(shù)比冷凍管、最小微滴法和不銹鋼網(wǎng)篩作載體有優(yōu)越之處，更適合人卵巢組織的有效玻璃化凍存。

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