張莎娜 王海平 曹 惠 王全立

1.解放軍總醫(yī)院輸血科，北京 100853；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院輸血科，北京 100071

血液及血液成分在儲(chǔ)存過(guò)程中會(huì)發(fā)生損傷，紅細(xì)胞自身的生化功能及形態(tài)也會(huì)發(fā)生改變。紅細(xì)胞懸液中的白細(xì)胞和血小板會(huì)自發(fā)的釋放許多生物活性物質(zhì)，多數(shù)活性分子會(huì)隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)而濃度升高。白細(xì)胞易崩解并釋放各種細(xì)胞因子（白介素等）。已有臨床報(bào)道，血液的貯存損傷會(huì)對(duì)心臟手術(shù)患者和創(chuàng)傷患者帶來(lái)不良的臨床效應(yīng)[1]，但由于發(fā)生原因復(fù)雜、臨床表現(xiàn)不明確，目前相關(guān)的臨床報(bào)道仍存在爭(zhēng)議。細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是引起急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的重要因素[2]。中性粒細(xì)胞（polymorphonuclear，PMN）是機(jī)體內(nèi)重要的炎癥反應(yīng)細(xì)胞[3]，為數(shù)量最多的白細(xì)胞。細(xì)菌LPS可以刺激PMN產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，但對(duì)其確切的內(nèi)在機(jī)制了解甚少，為了解大量庫(kù)存紅細(xì)胞的輸注對(duì)受者輸血免疫功能的影響，本研究采用體外實(shí)驗(yàn)的方法，在LPS的誘導(dǎo)下，觀察隨紅細(xì)胞保存時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)受者PMN炎癥釋放的作用?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下：1材料與方法

1.1 試劑

LPS購(gòu)自Sigma公司（試劑批號(hào)：L2880），中性粒細(xì)胞分離液購(gòu)自天津市川頁(yè)生化制品有限公司，IL-6和TNF-α試劑盒均購(gòu)自北京欣博盛生物科技有限公司。

1.2 懸浮紅細(xì)胞上清的制備

將制備好的懸浮紅細(xì)胞于4℃保存，分別于1、21、35 d（D1、D21、D35）無(wú)菌條件下取出 30 mL，1 500 r/min 離心 20 min得到上清，再將上清12 500 r/min離心5 min，去除細(xì)胞后分裝于-20℃凍存待集中測(cè)定。

1.3 全血中性粒細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及分組

取9份健康獻(xiàn)血者的全血，3 500 r/min離心15 min，得到富含白細(xì)胞的層面35～40 mL，分2～3次緩慢地等量加入到15 mL中性粒細(xì)胞分離液上，2 000 r/min離心25 min，吸取富含白細(xì)胞的中間層，再加入5倍體積以上的PBS，1 200 r/min離心10 min去除血小板；加入含 NH4Cl、NaHCO3溶血素2mL，37℃溶血 30min，溶解殘存的紅細(xì)胞；再加入少量的PBS，1 500 r/min離心10 min，去上清，余下的則為中性粒細(xì)胞；PBS洗滌2次，加入RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。經(jīng)Wright-Giemsa染色鑒定其純度＞95%[4]，然后進(jìn)行臺(tái)盼蘭排斥法證實(shí)其存活率＞98%。將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整到2×106/mL，將紅細(xì)胞懸液分為60份，分別進(jìn)行測(cè)定。

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入1.5 mL細(xì)胞懸液，細(xì)胞完全培養(yǎng)基由RPMI-1640、10%小牛血清、1%青鏈霉素組成（購(gòu)自上海微科生化試劑有限公司）。本實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，均各設(shè)一個(gè)空白對(duì)照，不加紅細(xì)胞上清，只加完全培養(yǎng)基，其余分別加入含20%D1、D21、D35的紅細(xì)胞上清的細(xì)胞完全培養(yǎng)基。對(duì)照組（30份）：未加LPS組，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清；實(shí)驗(yàn)組（30 份）：先培養(yǎng) 12 h 加入 1.5 μL、100 μg/mL的LPS，再培養(yǎng)12 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃、濕度100%、體積分?jǐn)?shù)5%CO2）中孵育。

1.4 細(xì)胞因子檢測(cè)

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，12 500 r/min離心5 min，去除細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6及TNF-α濃度采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)，按產(chǎn)品使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS 9.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用 t檢驗(yàn)；以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞上清細(xì)胞因子的表達(dá)情況

在各時(shí)間點(diǎn)收集的未加PMN的紅細(xì)胞上清中，均未檢測(cè)到IL-6和TNF-α。

2.2 兩組紅細(xì)胞上清中IL-6水平比較

在LPS的誘導(dǎo)下，D35、D21紅細(xì)胞上清中IL-6水平高于D1紅細(xì)胞上清（P＜0.05），其濃度隨紅細(xì)胞上清保存時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。與空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。對(duì)照組D1、D21、D35紅細(xì)胞上清中的IL-6水平高于空白對(duì)照，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組，D1、D21、D35的 IL-6水平分別比空白對(duì)照增長(zhǎng)（1.32±0.05）、（1.65±0.08）、（2.14±0.13）倍。 D1、D21、D35 之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組D1、D21、D35紅細(xì)胞上清中IL-6水平與對(duì)照比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組紅細(xì)胞上清中IL-6水平比較（±s，ng/L）

表1 兩組紅細(xì)胞上清中IL-6水平比較（±s，ng/L）

組別 例數(shù) 空白對(duì)照 D1 D21 D35對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組30 30 t值 P值83.04±35.61 384.73±45.82 28.48＜0.05 192.62±80.98 500.88±99.85 13.13＜0.05 275.84±80.26 634.45±99.71 23.90＜0.05 356.77±80.28 825.46±95.57 20.57＜0.05

2.3 兩組紅細(xì)胞上清中TNF-α水平比較

LPS誘導(dǎo)下，D35、D21的紅細(xì)胞上清中TNF-α水平高于D1紅細(xì)胞上清，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組D1、D21、D35紅細(xì)胞上清中TNF-α水平與對(duì)照比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

目前全世界都面臨血液資源日益緊張的境況，對(duì)于延長(zhǎng)血液保存時(shí)間、提高血液保存質(zhì)量的需求更為迫切。輸血相關(guān)的免疫變化可能是紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等儲(chǔ)存過(guò)程中所產(chǎn)生的可溶性物質(zhì)所引起的。LPS是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，是強(qiáng)有力的免疫炎癥系統(tǒng)活化因子，可引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致致死性感染性休克，病死率極高。本文參照文獻(xiàn)[5]，按照LPS的劑量效應(yīng)關(guān)系結(jié)果，選擇LPS的終濃度為 100 μg/mL。 參照輸血體外實(shí)驗(yàn)“雙重打擊”（two-hit）的模型[6]，采用LPS誘導(dǎo)，模擬臨床嚴(yán)重創(chuàng)傷后患者的炎癥反應(yīng)。嚴(yán)重創(chuàng)傷患者在其救治過(guò)程中需要大量輸血，這對(duì)患者的免疫功能影響很大。因此，培養(yǎng)PMN過(guò)程中加入20%上清，相當(dāng)于50 kg體重的臨床患者輸注12～15U的懸浮紅細(xì)胞?，F(xiàn)有研究表明，輸血相關(guān)的免疫反應(yīng)可能與血液保存過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)胞因子有關(guān)。炎癥細(xì)胞因子（IL-1、IL-6、IL-8和TNF-α）主要由外周的免疫細(xì)胞（包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）產(chǎn)生，通常介入免疫及炎癥反應(yīng)[7]，TNF-α能刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1間接刺激體溫中樞。本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的細(xì)胞因子均為參與炎癥反應(yīng)的重要的介質(zhì)。TNF-α可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，引起白細(xì)胞與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，黏附的中性粒細(xì)胞被激活可促發(fā)損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致水腫、炎癥反應(yīng)和缺血缺氧的惡性循環(huán)[8]。IL-6是炎癥和急性期反應(yīng)重要的細(xì)胞因子，其升高的水平與多器官功能衰竭風(fēng)險(xiǎn)增高有關(guān)。同時(shí)，IL-6和TNF-α共同作用上調(diào)免疫應(yīng)答，是促進(jìn)炎癥反應(yīng)、引起敗血癥的重要介質(zhì)[9]。這兩個(gè)細(xì)胞因子的變化可以間接解釋輸血引起的炎癥反應(yīng)。

表2 兩組紅細(xì)胞上清中TNF-α水平比較（±s，μmol/L）

表2 兩組紅細(xì)胞上清中TNF-α水平比較（±s，μmol/L）

組別 例數(shù) 空白對(duì)照 D1 D21 D35對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組t值P值30 30 77.59±7.61 79.45±9.82 0.83＞0.05 84.10±9.85 86.34±10.46 0.85＞0.05 87.66±10.44 89.78±11.71 0.74＞0.05 93.77±11.28 95.46±12.57 0.54＞0.05

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在LPS的誘導(dǎo)下，D35較D1紅細(xì)胞上清促使PMN釋放更多的TNF-α和IL-6，可以解釋為庫(kù)存血的輸注增強(qiáng)了PMN的炎癥反應(yīng)，這與Baumgartner等[5]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類(lèi)似。臨床救治時(shí)，同時(shí)大量輸注的血液保存時(shí)間并不相同，這可能是造成救助效果不明顯的原因之一，這種臨床效應(yīng)很多時(shí)候被臨床醫(yī)生忽視，或歸因于疾病的并發(fā)癥。提示在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中還應(yīng)進(jìn)行相關(guān)的基礎(chǔ)支持研究，努力明確輸血相關(guān)的副作用，提高臨床輸血安全。

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