李金榮，張薇，張西英，朱永軍

（1浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，杭州310000；2石河子大學農(nóng)學院／新疆兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，石河子832003；3山東煙臺南山學院，煙臺264006）

海島棉纖維品質(zhì)性狀的QTLs定位

李金榮1，張薇2，張西英2，朱永軍3

（1浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，杭州310000；2石河子大學農(nóng)學院／新疆兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，石河子832003；3山東煙臺南山學院，煙臺264006）

以海島棉（Gossypium barbadense L．）新海3號和Giza82組建包含190個單株的F2和F2∶3群體為材料，通過3800對SSR引物對親本進行篩選，獲得81個多態(tài)性標記。利用JoinMap3．0分析軟件構(gòu)建了1個包括18個連鎖群，48個SSR標記，標記間平均間距13．03cm，全長625．4cm，覆蓋海島棉基因組的14．09%的遺傳連鎖圖。采用復合區(qū)間作圖法檢測到4個海島棉纖維品質(zhì)性狀QTL，包括1個整齊度（FLU）、l個伸長率（FE）、1麥克隆值（FM）、1個成熟度指數(shù)（MI），分別解釋各性狀表型變異的11．83%、5．98%、12．38%和6．19%。本研究的結(jié)果為海島棉纖維品質(zhì)性狀的分子設(shè)計育種提供了有用的信息。

海島棉；品質(zhì)性狀；QTL定位

海島棉（Gossypium barbadense L．）是世界上重要的栽培棉種之一，占世界棉花生產(chǎn)的3%～8%，是紡織高檔紡織品和特種織物不可缺少的原料。新疆是我國唯一的海島棉產(chǎn)區(qū)，優(yōu)越的自然生態(tài)條件和集約化生產(chǎn)為新疆海島棉的發(fā)展提供了得天獨厚的發(fā)展優(yōu)勢。近年來，隨著紡織工業(yè)的迅速

發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，對棉花纖維品質(zhì)提出了更高的要求。傳統(tǒng)的育種方法通過雜交、回交和聚合雜交在改良纖維品質(zhì)方面取得了較大進展，但由于纖維品質(zhì)性狀的復雜性和低的選擇效率，傳統(tǒng)育種方法在進一步改良纖維品質(zhì)上存在較大困難。而現(xiàn)代DNA標記技術(shù)的發(fā)展，為育種者提供了一種快速、準確的選擇方法。利用高密度的分子遺傳圖譜，篩選與海島棉纖維品質(zhì)性狀緊密連鎖的分子標記，可在棉花生長的早期階段或育種早代對目標性狀的轉(zhuǎn)移進行跟蹤與選擇，從而提高纖維品質(zhì)的選擇效率，實現(xiàn)對品質(zhì)性狀的改良。

目前，國內(nèi)外學者開展了許多棉花纖維品質(zhì)QTL定位研究工作［1－10］。Kohel等［11］利用 TK－1和3－79的陸海雜交群體，定位了13個與纖維品質(zhì)有關(guān)的QTL，其中4個與強度有關(guān)，3個與纖維長度有關(guān)，6個與纖維細度有關(guān)；Paterson等［2］利用一個陸海種間F2∶3群體在灌溉與自然降雨條件下開展多環(huán)境試驗，共獲得68個與纖維品質(zhì)性狀有關(guān)的QTLs；Zhang等［4］利用一個高強纖維漸滲系7235，鑒定了一個與纖維強度有關(guān)的主效QTL，可解釋30%以上的表型變異，且在多環(huán)境中穩(wěn)定表達；Lin等［5］和 Zhang等［6］也分別利用不同分離群體鑒定出13個纖維品質(zhì)QTL，可解釋16．18%～28．92%的表型變異；楊鑫雷等［7］利用中棉所8號和Pima90－53的F2分離群體，檢測到25個與纖維品質(zhì)性狀有關(guān)的QTL。Shen等［8］利用3個陸地棉高強纖維種質(zhì)系構(gòu)建種內(nèi)連鎖圖，共篩選到38個與纖維品質(zhì)有關(guān)的QTL，15個穩(wěn)定的QTL能同時在F2和F2∶3中檢測到。但是，前人研究所用的材料多數(shù)是海陸種間雜交或陸地棉種內(nèi)雜交群體，定位的QTL直接應(yīng)用于海島棉的品質(zhì)改良比較困難。而海島棉品種間的遺傳差異較少，分子標記的多態(tài)性低，海島棉種內(nèi)遺傳圖譜研究相對落后。

本研究利用多態(tài)性高、穩(wěn)定性好的SSR標記構(gòu)建海島棉種內(nèi)遺傳連鎖圖譜，應(yīng)用復合區(qū)間作圖法對海島棉纖維品質(zhì)性狀進行QTL初步定位，旨在為利用分子標記輔助選擇改良海島棉纖維品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 群體的構(gòu)建與田間種植

本研究選用纖維品質(zhì)差異較大的海島棉品種新海3號與Giza82于2006年在石河子大學庫爾勒試驗站進行雜交。同年冬天在海南種植F1代，自交獲得F2代種子。2007年種植F2群體，從中隨機抽取190株自交產(chǎn)生F2∶3家系構(gòu)成作圖群體。2008年4月種植親本及F2∶3家系，每個家系種植1行，行長5 m，株距10cm，正常大田管理。

1．2 性狀的調(diào)查

收獲時，親本及各家系選取有代表性的10個單株收花，扎花后每個樣品取10g纖維測定品質(zhì)性狀。纖維檢測由農(nóng)業(yè)部棉花質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（烏魯木齊）完成，檢測指標包括纖維長度（fiber length，F(xiàn)L，mm），纖維強度（fiber strength，F(xiàn)S，cN／tex），麥克隆值（fiber micronaire value，F(xiàn)M），整齊度（fiber length uniformity，F(xiàn)LU，%），伸長率（fiber elongation，F(xiàn)E，%），短纖維指數(shù)（short fiber index，SFI，%），成熟度指數(shù)（maturity index，MI）7個纖維品質(zhì)指標。

1．3 SSR引物

實驗共篩選3800對SSR引物，其中1800對來自浙江大學農(nóng)學院，2000對來自新疆綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，引物序列由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1．4 DNA的提取和SSR分析

基因組DNA的提取采用改良的CTAB法［11－13］。SSR的分析流程參照文獻［14－15］中的方法。

SSR標記的PCR反應(yīng)總體積為10μL，包括50 ng／μL模板DNA 1．2μL，10×PCR Buffer 1．4μL，

10mmol／L dNTPs 0．2μL，2．5U／μL Taq DNA 聚合酶0．2μL，1mM 正向及反向引物各0．5μL，水6．0μL。

PCR反應(yīng)程序為：95℃2min；94℃50s，54℃30s，72℃20s，36個循環(huán)；72℃3min；退火溫度因引物而不同，主要有54、56、58℃三個溫度。擴增產(chǎn)物用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染檢測。

1．5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件對F2∶3各家系的纖維品質(zhì)性狀進行統(tǒng)計分析，利用JoinMap3．0數(shù)據(jù)分析軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，通過 MapQTL5．0分析軟件采用復合區(qū)間作圖法進行纖維品質(zhì)性狀的QTL定位和效應(yīng)檢測。

LOD值3．0表示顯著性QTL，LOD值2．0～3．0表示可能性QTL。計算每個QTL對相應(yīng)性狀的貢獻率、加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)。檢測到的QTL，若顯性效應(yīng)／加性效應(yīng)達到0～0．2為加性，0．21～0．8為部分顯性，0．81～1．2為顯性，大于1．2認為該QTL表現(xiàn)超顯性。

QTL命名方法參照水稻研究的方法［16］，按照QTL＋性狀＋染色體＋QTL個數(shù)，其中QTL以小寫“q”開始，性狀以英文縮寫表示，后接染色體或連鎖群的編號，最后是該染色體上控制此性狀的QTL的數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2．1 親本和F2∶3家系纖維品質(zhì)性狀的表型分析

親本材料的選擇對于遺傳圖譜的構(gòu)建和性狀QTL定位具有重要作用，本研究選用2個纖維品質(zhì)性狀差異較大的海島棉品種構(gòu)建作圖群體，為成功構(gòu)建遺傳圖譜奠定了基礎(chǔ)。親本及F2∶3家系的纖維品質(zhì)性狀見表1。

由表1可知：Giza82是一個纖維強度高、整齊度好、短絨指數(shù)較低的品種，但其麥克隆值高、纖維偏短。而新海3號馬值適合、成熟好、纖維比較長，但強度、整齊度較差。兩親本間纖維品質(zhì)性狀差異較大，且性狀間存在互補。在F2∶3群體中，7個品質(zhì)性狀的平均值均介于2個親本之間，其中纖維長度、纖維強度、成熟度指數(shù)的平均值接近雙親中值；伸長率、短絨指數(shù)的均值接近于高值親本，存在超親分離；麥克隆值、整齊度均值接近于低值親本。F2∶3群體各性狀均表現(xiàn)為連續(xù)分布，呈現(xiàn)多基因控制的數(shù)量性狀的遺傳特點。

表1 親本及F2∶3家系纖維品質(zhì)性狀的表型變異Tab．1Phenotypic variation of the fiber quality traits in F2∶3families and the parent lines

2．2 引物多態(tài)性分析

選用3800對SSR引物對新海3號和Giza82兩個親本的多態(tài)性進行篩選，共獲得81個穩(wěn)定的SSR多態(tài)性位點，多態(tài)性頻率為2．1%。對標記位點進行χ2適合性檢驗，81個標記位點中有33個偏離孟德爾分離比例，偏分離比例為40．7%。其中有19個標記偏向于母本新海3號，有14個標記偏向于父本吉扎82。

2．3 遺傳圖譜構(gòu)建

利用JoinMap3．0分析軟件，對81個SSR標記位點進行遺傳連鎖分析，初步構(gòu)建了一個包含48個標記、18個連鎖群的連鎖圖譜。根據(jù)連鎖群的長度，由大到小依次將18個連鎖群命名為LG1至LG18。該圖譜總長625．4cm，覆蓋海島棉基因組的14．09%。標記間平均遺傳距離13．03cm，最大遺傳距離53．8cm，最小遺傳距離為0．3cm，每個連鎖群包含2～6個標記，平均每個連鎖群的標記數(shù)是2．6個。另外33個標記獨立。

2．4 纖維品質(zhì)性狀的QTL定位及分析

運用MapQTL5．0軟件，利用復合區(qū)間作圖法原理對新海3號×Giza82群體的纖維品質(zhì)性狀進行基因組掃描，共檢測到4個與纖維品質(zhì)相關(guān)的QTL（表2、圖1）。其中檢測到1個影響整齊度的QTL，其分布在第一連鎖群上，能解釋整齊度變異的11．83%。Giza82的等位基因增加性狀的表型值，表現(xiàn)為超顯性效應(yīng)；檢測到1個影響海島棉伸長率的QTL，其分布在第一連鎖群上，能解釋伸長率變異的5．98%。Giza82的等位基因增加性狀的表型值，表現(xiàn)為部分顯性效應(yīng)；檢測到1個影響馬克隆值的QTL，分布在第一連鎖群上，能解釋馬克隆值變異的12．38%。Giza 82的等位基因減少性狀的表型值，表現(xiàn)為加性效應(yīng)；檢測到1個成熟度指數(shù)的QTL，分布在第一連鎖群上，能解釋成熟度指數(shù)變異的6．19%。Giza82的等位基因減少性狀的表型值，表現(xiàn)為部分顯性效應(yīng)。

表2 纖維品質(zhì)性狀QTL的位置與效應(yīng)Tab．2QTL posotions and effects on fiber quality traits

圖1 纖維品質(zhì)性狀QTL定位Fig．1QTLs mapping for fiber quality traits

3 討論

建立高密度飽和的遺傳連鎖圖譜是基因定位的基礎(chǔ)。異源四倍體棉花的DNA標記多態(tài)性低，而種內(nèi)（海海雜交和陸陸雜交）的分子標記多態(tài)性又低于陸地棉與海島棉種間的多態(tài)性。王娟等［17］利用5 544對SSR引物篩選陸地棉TM－1和渝棉1號間的多態(tài)性，多態(tài)性引物占3．2%。艾先濤等［18］利用496對SSR引物篩選中棉所35和9－1696間的差異，獲得12對多態(tài)性引物，多態(tài)性引物占2．4%。為了獲得較大的多態(tài)性，棉花的遺傳連鎖圖多是基于陸海種間雜交群體的，在海島棉育種中難以直接利用。因此，以海島棉種內(nèi)雜交群體為材料構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，將更有利于海島棉育種實踐。本研究利用3800對SSR引物篩選海島棉品種新海3號和Giza82間的差異，獲得81對多態(tài)性引物，多態(tài)性引物占2．1%，構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜總長625．4cm，覆蓋海島棉基因組14．09%，為海島棉QTL定位奠定一定基礎(chǔ)。

現(xiàn)有研究表明，棉花纖維品質(zhì)性狀、產(chǎn)量性狀等農(nóng)藝性狀QTL在染色體上呈現(xiàn)成簇分布的特點［8－10，17－21］。Ulloa等［19］研究發(fā)現(xiàn)，92個控制農(nóng)藝性狀和纖維品質(zhì)性狀的QTL大約49%都集中分布在2個不同的染色體上，認為控制纖維品質(zhì)有關(guān)的基因在棉花同一染色體上可能簇生。王娟等［17］和Shen等［8］研究發(fā)現(xiàn)，不同優(yōu)質(zhì)供體的QTL有集中分布的趨勢，主要分布在chr．23和chr．24上。秦永生等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在雜交棉湘雜2號中D2染色體上0～13cm區(qū)域集中了纖維長度、纖維強度、纖維細度等5個性狀的6個QTL，在D9上有2個QTL富集區(qū)，在D13、A11上也有類似現(xiàn)象。陳利等［9］利用陸地棉中棉所35和渝棉1號建立F2群體，研究發(fā)現(xiàn)在第7染色體上同一區(qū)間檢測到衣分、鈴重、籽指、纖維長度和纖維比強度5個QTL。多群體揭示的性狀相關(guān)基因成簇分布現(xiàn)象可部分地解釋有關(guān)性狀間的表型相關(guān)，但是這種現(xiàn)象是由基因連鎖還是一因多效引起的，有待深入研究。本研究定位的4個與海島棉品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL均分布在第一連鎖群，其中NAU4936～NUSB0645分布了麥克隆值和成熟度指數(shù)2個QTL，這為從分子水平解釋性狀之間的相關(guān)關(guān)系提供了一種可能。

4 結(jié)論

利用海島棉種內(nèi)雜交（新海3號XGiza82）F2群體，對81個標記位點進行遺傳連鎖分析，構(gòu)建了總長625．4cM，覆蓋海島棉基因組的14．09%的遺傳連鎖圖。用復合區(qū)間作圖法在F2群體中共檢測到4個纖維品質(zhì)的QTL，即1個整齊度（FLU），l個伸長率（FE），1麥克隆值（FM），1個成熟度指數(shù)（MI），4個QTL均位于第1連鎖群，該連鎖群是優(yōu)質(zhì)纖維QTL的富集區(qū)。

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QTLs Mapping for Fiber Quality Traits in Sea－Island Cotton（Gossypium barbadense L．）

LI Jinrong1，ZHANG Wei2，ZHANG Xiying2，ZHU Yongjun3
（1College of Agronomy and Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang 310000，China；2College of Agronomy，Shihezi University／The Key Oasis Eco－agriculture Laboratory of Xinjiang Production and Construction Group，Shihezi 832003，China；2Nansan College，Yantai 264006，China）

Sea－island cotton is one of the world’s most important natural textile fiber．It plays an important role in the textile industry worldwide．In this paper，agenetic linkage map was constructed by the F2and F2∶3population derived from cross between two sea－island cotton cultivars‘Xinhai 3’and‘Giza 82’．We identified 81polymorphic loci with 3800pairs of SSR primers．Using Joinmap3．0software，agenetic linkage map of sea－island cotton with 48loci was constructed，which comprised of 18linkage groups covering 625．4cm with an average interval of 13．03cm between the two neighbor markers，and approximately 14．09%of the whole cotton genome．Based on composite interval mapping，4QTLs related with fiber quality traits of the sea－island cotton were detected，1for fiber length uniformity，1for fiber elongation，1for fiber micronaire value，and 1for maturity index．These QTLs explained their corresponding phenotypic variations with 11．83%，5．98%，12．38%and 6．19%，respectively．This research could provide valuable information for the molecular design breeding of fiber quality in sea－island cotton．

Sea－island cotton；fiber quality；QTLs mapping

S562．035．2

A

2011－12－30

國家轉(zhuǎn)基因?qū)ｍ椬訉ｎ}（2008ZX08005－005），石河子大學動植物育種專項（GXJS2009－YZ08）

李金榮（1984－），女，博士研究生，研究方向生物技術(shù)在遺傳育種中的應(yīng)用。

張薇（1969－），女，教授，從事棉花分子育種研究；e－mail：zhw_agr＠shzu．edu．cn。