董江濤，徐芳，田璽擇，姚楠，吳芳，章樂，王遠志，曹旭東，張萬江

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子832002）

結(jié)核分枝桿菌感染小鼠肺泡巨噬細胞誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3分泌表達模型的建立及鑒定

董江濤，徐芳，田璽擇，姚楠，吳芳，章樂，王遠志，曹旭東，張萬江

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院／新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，石河子832002）

為了建立及鑒定結(jié)核分枝桿菌感染小鼠肺泡巨噬細胞誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3分泌表達的模型。采用將0．3mL濃度約為1．0×107個／mL結(jié)核分枝桿菌菌懸液經(jīng)昆明小鼠尾靜脈注射，復(fù)制結(jié)核分枝桿菌感染小鼠模型，經(jīng)鑒定小鼠感染模型復(fù)制成功后第15天，進行小鼠肺泡的灌洗，收集小鼠肺泡灌洗液，獲取感染小鼠肺泡巨噬細胞，以提取的感染小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模版PCR擴增結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3的基因，同時進一步利用激光共聚焦顯微鏡觀察小鼠肺泡巨噬細胞的方法進行研究。PCR結(jié)果證實感染結(jié)核分支桿菌的巨噬細胞內(nèi)有結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16．3的基因表達；同時激光共聚焦顯微鏡下可見感染小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)吞噬有大量結(jié)核分枝桿菌，并且證實有結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16．3的分泌表達。成功建立了結(jié)核分枝桿菌感染小鼠肺泡巨噬細胞誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3分泌表達的模型。

結(jié)核分枝桿菌；肺泡巨噬細胞；結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3；表達；模型

結(jié)核病是單基因所致感染性疾病中死亡率最高的疾病，據(jù)2005年報道，全球有近1／3的人（即20億人口）已感染結(jié)核桿菌，每年死于結(jié)核病的人數(shù)達200萬人。據(jù)世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）統(tǒng)計，全球二十二個結(jié)核病高負荷國家中，中國僅次于印度，居世界第二位，其中約有460萬人為活動性肺結(jié)核［1］。因此我國的結(jié)核病防治工作面臨著嚴峻的考驗；迫切需要對結(jié)核病進一步研究，以控制近年來發(fā)病率不斷增高的態(tài)勢。結(jié)核病的致病菌——結(jié)核分枝桿菌是典型的胞內(nèi)致病菌，主要在巨噬細胞等宿主免疫系統(tǒng)的細胞內(nèi)存活和繁殖。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16．3是一個組成性表達蛋白，正常條件下僅有少量表達，感染巨噬細胞后，表達量增加，結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3的表達則可能與結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)的休眠機制有關(guān)［2］。因此，建立結(jié)核分枝桿菌感染小鼠肺泡巨噬細胞誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3分泌表達模型，為深入研究結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3在結(jié)核病發(fā)病機制中的作用，闡明結(jié)核病的發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物 昆明種小鼠，6～8周齡，體重（18±2）g，購自石河子大學(xué)實驗動物中心。

1．1．2 所用菌株 結(jié)核分枝桿菌國際標準強毒株H37Rv菌株和卡介苗菌株購自中國藥品生物制品檢定所。

1．1．3 主要試劑與儀器設(shè)備 Mycobacterium tuberculosis 16kDA antibody［HTM63］（只針對結(jié)核分枝桿菌的16kDA的小鼠單克隆抗體）、熒光二抗（山羊抗小鼠）、激光共聚焦顯微鏡、生物安全柜、PCR儀。

1．2 方法

1．2．1 實驗分組 實驗分3組：結(jié)核分枝桿菌國際標準強毒株H37Rv菌株組、卡介苗菌株組和空白對照組。

1．2．2 菌懸液的制作和結(jié)核分枝桿菌感染小鼠模型復(fù)制及鑒定 在生物安全柜內(nèi)，用接種環(huán)挑取，在改良羅氏固體培養(yǎng)基上生長2～3周的狀態(tài)良好的結(jié)核分枝桿菌菌落，放入高壓滅菌好的磨菌器中，加入少量0．05%Tween－20的生理鹽水充分研磨，使其成均勻渾濁的菌懸液。通過麥氏比濁法調(diào)整細菌濃度約為1．0×107個／mL。然后經(jīng)小鼠尾靜脈將不同的菌懸液分別注射到對應(yīng)分組的小鼠體內(nèi)，每只小鼠的菌懸液注射量約為0．3mL，對照組注射同等量的生理鹽水。感染結(jié)核分枝桿菌后的小鼠必須要在生物安全三級實驗室內(nèi)，IVC籠具中飼養(yǎng)。

1．2．3 感染模型小鼠肺泡巨噬細胞的收集及培養(yǎng)

參照文獻［3］的方法，并加以改進。感染15d的實驗小鼠，經(jīng)眼球后放血后，脫頸處死，暴露支氣管，用消毒好的剪刀在氣管上做一切口（切勿剪斷），用連有注射器的無菌軟皮管從切口處插入氣管，絲線固定，用4℃預(yù)冷PBS液行氣管肺泡灌洗，每次1 mL，共10次，離心管收集支氣管肺泡灌洗，4℃1500r／min離心10min，倒掉上清液加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中。置37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)4h，貼壁細胞即為小鼠肺泡巨噬細胞。3組小鼠均按上述操作，分別收集結(jié)核分枝桿菌感染小鼠的肺泡巨噬細胞。

1．2．4 利用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測各組結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3的表達 （1）細胞制備：收集小鼠肺泡巨噬細胞，用10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸，將細胞懸液均勻鋪到六孔板（內(nèi)置預(yù)先滅菌處理過的蓋玻片）中，置于37℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)4h。（2）細胞固定：取出蓋玻片，用PBS侵洗，然后放入4%多聚甲醛固定液中，室溫下靜置固定15min，蒸餾水沖洗3次。（3）固定好的細胞玻片放入濕盒中，滴加山羊血清封閉液，室溫20min，甩去多余液體，勿沖洗。（4）滴加稀釋后的一抗，均勻鋪在玻片上，濕盒內(nèi)放置，4℃過夜。（5）PBS沖洗3min×3次，滴加熒光二抗，室溫2h，PBS沖洗干凈，硝酸甘油封片。（6）激光共聚焦顯微鏡觀察熒光強度及著色部位。

1．2．5 結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3基因的擴增 （1）小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)吞噬的結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的提取于感染模型復(fù)制成功后第15天，收集不同感染組的小鼠肺泡巨噬細胞（方法同前），參考文獻［4］中的具體操作步驟，分別提取結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株和BCG菌株的基因組DNA。

（2）引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中結(jié)核分枝桿菌Hsp16．3基因序列設(shè)計引物，序列如下：

上 游 引 物：5′－CGCGGATCCATGGCCACCACCACCCTTC－3′，

下游引物：5′－CCCAAGCTTTCAGTTGGTGGACCGG－3′。

引物由上海生工生物工程公司合成。

（3）分別以提取的結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組DNA和BCG基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR擴增體系參數(shù)為：94℃5min；94℃45 s，62℃ 45s，72℃ 50s，共30個循環(huán)，72℃ 10 min。待反應(yīng)完畢，取5μL PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR產(chǎn)物純化按照文獻［5］及試劑盒說明書進行，純化后的PCR擴增產(chǎn)物送公司做基因測序鑒定。

2 結(jié)果與分析

2．1 結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3基因的擴增

以提取的感染小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模版，PCR擴增結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3的基因，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均顯示為大小約435bp的特異性擴增條帶，見圖1。

圖1 結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3基因的PCR擴增產(chǎn)物Fig．1PCR products of gene HSP16．3of Mycobacterium tuberculosis

PCR產(chǎn)物純化并送北京六合華大基因公司測序。基因測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫所收錄的Hsp16．3基因一致。表示結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株和BCG菌株被宿主巨噬細胞吞噬后均伴有小分子熱休克蛋白HSP16．3的表達。

2．2 利用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測各組結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3的表達

在激光共聚焦顯微鏡下觀察到：結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株和BCG菌株感染的小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)均可見大量綠色熒光（圖2、圖3），僅用生理鹽水的對照組則未見綠色熒光。圖4表明結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株和BCG菌株被小鼠肺泡巨噬細胞大量吞噬，同時均伴有結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16．3的表達。

圖2 結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株感染小鼠模型復(fù)制鑒定后第15天，所提取的小鼠肺泡巨噬細胞在激光共聚焦鏡下的形態(tài)學(xué)觀察（400×）Fig．2Infected with Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain 15days later identification copied，extracted mouse alveolar macrophages in the confocal microscope morphology（400×）

圖4 注射生理鹽水的小鼠第15天，所提取的小鼠肺泡巨噬細胞在激光共聚焦鏡下的形態(tài)學(xué)觀察（400×）Fig．4Mice injected with saline 15days later，the extracted mouse alveolar macrophages in the confocal microscope morphology（400×）

3 討論

結(jié)核病的致病菌—結(jié)核分枝桿菌是典型的胞內(nèi)致病菌，主要在巨噬細胞等宿主免疫系統(tǒng)的細胞內(nèi)存活和繁殖，但目前機體抗結(jié)核的免疫機制尚不清楚，有待進一步的探索和研究。

C57BL／6J品系小鼠和昆明小鼠可用作建立結(jié)核分枝桿菌感染實驗的動物模型。雖然就近交系和遠交系而言，C57BL／6J系小鼠是結(jié)核分枝桿菌實驗動物模型的首選［6］，但昆明小鼠對結(jié)核分枝桿菌也具有很強的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染宿主后，隨著機體抗結(jié)核免疫效應(yīng)的建立，巨噬細胞通過自身的凋亡達到殺死和清除結(jié)核分枝桿菌的目的，巨噬細胞凋亡率逐漸升高，一般在10d內(nèi)即可達到頂峰。然后逐漸降低，至感染第15天結(jié)核分枝桿菌大多以休眠狀態(tài)存在于巨噬細胞中，形成所謂的“逃避”，使自身的存活、繁殖與宿主的一系列免疫反應(yīng)達到一種動態(tài)平衡［7］。結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3的表達則可能與結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)的休眠機制有關(guān)，本實驗研究是用結(jié)核分枝桿菌菌懸液經(jīng)昆明小鼠尾靜脈注射，復(fù)制結(jié)核分枝桿菌感染小鼠模型，經(jīng)鑒定小鼠感染模型復(fù)制成功后第15天，進行小鼠肺泡的灌洗，收集小鼠肺泡灌洗液，獲取感染小鼠肺泡巨噬細胞，進一步利用激光共聚焦顯微鏡觀察小鼠肺泡巨噬細胞，以提取的感染小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模版，PCR擴增結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3基因。利用激光共聚焦顯微鏡下觀察到，結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株組和BCG菌株組的大部分小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)均出現(xiàn)了特異性抗體標記的綠色熒光，而對照組無熒光出現(xiàn)。結(jié)果表明：感染小鼠肺泡巨噬細胞內(nèi)吞噬有大量結(jié)核分枝桿菌，并有結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16．3的分泌表達，同時PCR結(jié)果證實有結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白Hsp16．3的基因表達。PCR擴增產(chǎn)物，經(jīng)純化后測序，結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的Hsp16．3基因一致，表明結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株和BCG菌株被宿主巨噬細胞吞噬后均伴有結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3的表達。

近年來關(guān)于結(jié)核分枝桿菌感染宿主巨噬細胞并誘導(dǎo)自身表達合成結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3的研究國內(nèi)外鮮有報道。本研究成功建立了結(jié)核分枝桿菌感染小鼠肺泡巨噬細胞誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3分泌表達模型，為深入研究結(jié)核分枝桿菌小分子熱休克蛋白HSP16．3在結(jié)核病發(fā)病機制中的作用，闡明結(jié)核病的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

［1］Mitra G，Saha A，Gupta T D，et al．Chaperone－mediated inhibition of tubulin self－assembly［J］．Proteins，2007，67（1）：112－120．

［2］Fu X，Chang Z．Identification of bis－ANS binding sites in Mycobacterium tuberculosis small heat shock protein Hsp16．3：evidences for a two－step substrate－binding mechanism［J］．Biochem Biophys Res Commun，2006，349（1）：167－171．

［3］陳秀芳，金麗琴，呂建新，等．蟬擬青霉對大鼠腹腔及肺泡巨噬細胞的激活作用［J］．中國病理生理雜志，2002，18（6）：694－697．

［4］Zhang ZQ，Muhammad I．Evaluation of methods for isolation of DNA from slowly and rapidly growing Mycobacteria［J］．International Journal of Leprosy，1997，65（4）：469－476．

［5］Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T，et al．分子克隆實驗指南·第2版［M］．北京：科學(xué)出版社，1996，674－676．

［6］盧潤生，漆浩珊，劉楊椅，等．結(jié)核菌實驗動物探討［J］．中國防癆通訊，1990，12（3）：118－119．

［7］Rengarajan J，Bloom B R，Rubin E J．Genome－wide requirements for Mycobacterium tuberculosis adaptation and survival in macrophages［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2005，102：8327－8332．

Establishment and Identification of the Expression Model of Mycobacterium Tuberculosis HSP16．3Induced by MTB－infected Alveolar Macrophages in Mice

DONG Jiangtao，XU Fang，TIAN Xize，YAO Nan，WU Fang，ZHANG Le，WANG Yuanzhi，CAO Xudong，ZHANG Wanjiang
（School of Medicine／Key Laboratory of Xinjiang Endemic ＆ Ethnic Disease of Ministry of Education，Shihezi University，Shihezi 832002，China）

To establish and identify the expression model of Mycobacterium tuberculosis HSP16．3induced by MTB－infected alveolar macrophages in mice．The study used 0．3mL M．tuberculosis suspension at a concentration of 1．0×107pieces／mL to inject the mice through tail vein to replicate models of mice infected with M．tuberculosis．15dafter the successful replication of the model，we lavaged the alveolar of mice and collected the lavaged liquid to obtain alveolar macrophages of the infected mice．The gene coding for Hsp16．3 was amplified through PCR from the DNA of M．tuberculosis in the alveolar macrophages of infected mice，and con－focal laser scanning microscopy，CLSM，was used for the observation of alveolar macrophages．The results of PCR confirmed the expression of the M．tuberculosis Hsp16．3in alveolar macrophages，and CLMS found a large number of M．tuberculosis within alveolar macrophages of the infected mice and proved the expression of M．tuberculosis Hsp16．3．This study succeeded in establishing the expression model of M．tuberculosis Hsp16．3induced by MTB－infected alveolar macrophages in mice．

Mycobacterium tuberculosis；alveolar macrophages；Mycobacterium tuberculosis HSP16．3；expression；model

R378．99

A

2011－11－02

國家自然科學(xué)基金項目（30960355，30760237）

董江濤（1983－），男，碩士生，專業(yè)方向為感染免疫；e－mail：xinxinjiangtao＠163．com。

張萬江（1967－），男，教授，博士生導(dǎo)師，從事感染性疾病的病理生理學(xué)研究；e－mail：zwj1117＠sina．com。