彭利劍，趙曉盼，王海杰，趙文秀 (.德惠市人民醫(yī)院檢驗科，吉林 德惠 30300;.吉林醫(yī)藥學(xué)院008級藥學(xué)本科，吉林吉林 303;3.吉林醫(yī)藥學(xué)院化學(xué)教研室，吉林吉林 303)

中國是茶文化的發(fā)源地，傳統(tǒng)中醫(yī)、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)都重視茶的藥用研究［1］。糖多糖除具有降血脂、防治血栓和增強免疫等功效外，近年來還發(fā)現(xiàn)粗制多糖對多種腫瘤有抑制作用［2］。我國的產(chǎn)茶區(qū)分布廣，茶葉品種多，但對茶的成分和功效影響最大的卻是茶葉發(fā)酵的程度。綠茶為非發(fā)酵茶，紅茶為充分發(fā)酵茶，而烏龍茶屬于半發(fā)酵茶。茶的鮮葉經(jīng)發(fā)酵后所含的多酚被氧化、葉綠素被分解，因此變?yōu)榧t色、褐色或黑色;此過程中糖的含量和結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變［3］。目前認為，紅茶的糖類含量相對高，組成與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，從中提取多糖抗腫瘤的研究受到重視。本研究以中國福建的“正山小種”紅茶為原料，采用水浸泡的方式提取茶多糖，用大孔樹脂層析法制備純化的紅茶多糖(black tea polysaccharides，bTPS)，并采用酪胺還原法標(biāo)記異硫氰酸熒光素(fluorescinisothiocyate，F(xiàn)ITC)，以bTPS和FITC-bTPS為材料，研究純化紅茶多糖對白血病細胞增殖的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人白血病細胞K562和U937凍存于液氮中;自制bTPS和FITC-bTPS避光保存于-20℃;1640培養(yǎng)液購自Hyclone公司;小牛血清購自浙江黃巖四季青公司;CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

復(fù)蘇K562細胞和U937細胞，在含10%血清的1640培養(yǎng)液、37℃和5%CO2條件下培養(yǎng)，每周傳代3次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞增殖檢測

將細胞濃度調(diào)整為104/mL，按每孔100 μL接種96孔板，用1640培養(yǎng)稀釋 bTPS，分別加入到96孔板，使終濃度分別為 0、25、50、75 和 100 μg/mL。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，空白對照組加入10 μL的PBS。37℃孵育2 h后，用多功能酶標(biāo)儀檢測各孔在450 nm的吸光度值(A450)。按照下列公式計算細胞增殖抑制率(inhibition rate，IR)

1.4 輻射條件及測量工具

取對數(shù)生長期細胞，調(diào)密度為5×106/mL。取100 μL細胞懸液，加FITC-bTPS使其終濃度分別為0、25、50 和 100 μg/mL，室溫下避光反應(yīng) 1 h 后 PBS洗2次，將細胞懸于250 μL PBS，加入等體積的4%多聚甲醛，細胞被固定于2%的多聚甲醛。相同方法加入50 μg/mL的FITC-bTPS，與細胞共同孵育時間分別0、30、60和120 min，洗滌后固定細胞。細胞樣品避光存放于4℃冰箱，24 h內(nèi)完成流式細胞術(shù)分析。先以無FITC-bTPS處理的細胞為陰性對照組，收集細胞在FL1(525 nm)通道內(nèi)的熒光信號;調(diào)節(jié)電壓和增益，使細胞群位于陰性區(qū)域內(nèi)，設(shè)置陰性門“N”和陽性門“P”。來檢測各實驗組細胞，以陽性細胞的百分率和陽性細胞群平均熒光強度(mean)來顯示FITC-bTPS與細胞間的結(jié)合。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

以3次獨立實驗的平均值代表最終結(jié)果，均數(shù)間的比較采用t檢驗，顯著性標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 bTPS抑制白血病細胞增殖

隨濃度增加(0、25、50、75 和 100 μg/mL)，U937和K562細胞的增殖受到顯著抑制，相同濃度下bTPS對U937細胞抑制作用強于K562細胞 (P＜0.05)(圖1)。

圖1 bTPS抑制U937和K562細胞增殖

2.2 FITC-bTPS與白血病細胞結(jié)合

50 μg/mL的 FITC-bTPS 反應(yīng)1 h，U937 和 K562細胞中陽性百分率接近;但前者熒光強度值高(P＜0.05)(圖2)。通過分析發(fā)現(xiàn)，U937細胞陽性率隨FITC-bTPS濃度增加而增加(表1);但反應(yīng)時間對陽性率影響較小(表2)。

圖2 FITC-bTPS與U937和K562細胞結(jié)合

表1 濃度對FITC-bTPS結(jié)合白血病細胞的影響(S)

表1 濃度對FITC-bTPS結(jié)合白血病細胞的影響(S)

*對照組比較，P＜0.05

組 別g/mL 21.3±3.4 18.4±3.7 50 μg/mL 44.8 ±4.5* 43.2 ±5.1*100 μg/mL 67.5 ±6.3* 64.2 ±5.2 U937 K562 25 μ*

表2 孵育時間對FITC-bTPS結(jié)合白血病細胞的影響(S)

表2 孵育時間對FITC-bTPS結(jié)合白血病細胞的影響(S)

*對照組比較，P＜0.05

組 別U937 K562 30 min 41.3±4.2 39.5±3.9 60 min 44.8±4.5 51.6±5.7*120 min 43.2±5.1 47.5±4.8*

3 討論

多糖(polysaccharides)是由單糖之間脫水而形成糖苷鍵，并以糖苷鍵線性或分枝連接而成的聚合物。多糖廣泛存在于動物細胞膜、植物和微生物細胞壁中，參與細胞的各種生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)［3］。人們對動物來源的殼聚糖，植物來源的靈芝多糖和細菌來源的脂多糖、甘露糖等多糖的研究較多，上述多糖均具有一定的免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤活性。甘露聚糖與細胞膜上甘露糖受體結(jié)合，而殼聚糖和脂多糖與Toll樣受體家族(Toll like receptors，TLRs)中的 TLR-2、TLR-4和TLR-7結(jié)合［4］。單核巨噬細胞TLR-4等結(jié)合配體后，細胞內(nèi)的p-38 MAPK信號通路被激活，啟動IL-2、IL-8、TNF-α 和 IFN-γ 等細胞因子基因轉(zhuǎn)錄，增強單核巨噬細胞吞噬、殺傷功能;而活化巨噬細胞可通過釋放細胞因子等方式促進T細胞的活化。雖然大量實驗表明多糖可通過調(diào)節(jié)免疫功能抗腫瘤，但近年來多糖分子抑制腫瘤細胞增殖或誘導(dǎo)其凋亡的證據(jù)也陸續(xù)被報道。例如，靈芝多糖直接誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的白血病細胞THP-1和HL-60細胞發(fā)生凋亡;殼聚糖抑制乳腺癌細胞 MCF-7增殖并誘導(dǎo)其凋亡［5-6］。以往對茶葉抗腫瘤成分的研究主要集中于多酚化合物，因此茶多糖對腫瘤細胞的直接作用了解較少。本研究發(fā)現(xiàn)，純化的bTPS可以濃度依賴的方式直接抑制兩種白血病細胞的增殖。FITC-bTPS結(jié)合細胞后，流式細胞術(shù)分析其以濃度依賴的方式與細胞結(jié)合。相同濃度的FITC-bTPS處理后，U937細胞的平均熒光強度高于K562細胞，而bTPS對U937的抑制效應(yīng)也強于K562細胞。這些結(jié)果表明，bTPS可直接結(jié)合腫瘤細胞而抑制其增殖。

利用純化的bTPS和FITC-bTPS，不僅可以測定茶多糖對腫瘤細胞增殖、凋亡的影響，也可利用熒光素的示蹤作用，深入探討其抗腫瘤的機制。bTPS是否也與細胞表面的TLRs結(jié)合而發(fā)揮作用，將在今后的實驗中繼續(xù)探討。

［1］謝明勇，聶少平.茶葉多糖的研究進展［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報，2006，25(2):107-114.

［2］崔宏春，江和源，張建勇，等.茶多糖的結(jié)構(gòu)研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(1):200-203.

［3］沈 健，陳增良，沈香娣，等.茶多糖抗腫瘤及其增強免疫作用的研究［J］.浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2007，19(8):10-12.

［4］毛 華，楚慧麗，劉月冉，等.免疫細胞多糖受體及其研究方法［J］.食品與藥品，2011，13(3):136-138.

［5］Jiang M，Ouyang H，Ruan P，et al.Chitosan derivatives inhibit cell proliferation and induce apoptosis in breast cancer cells［J］.Anticancer Res，2011，31(4):1321-1328.

［6］Wang J H，Zhou Y J，Zhang M，et al.Active lipids of Ganoderma lucidum spores-induced apoptosis in human leukemia THP-1 cells via MAPK and PI3K pathways［J］.J Ethnopharmacol，2012，139(2):582-589.