俞 星，韓春姬，樸惠善，李 琚

(1.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研部，吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)教研部，吉林 延吉 133002；3.延邊大學(xué)藥學(xué)院藥物化學(xué)教研部，吉林 延吉 133002)

原發(fā)性肝癌由于發(fā)病隱匿、惡性度高、生長快等特點(diǎn)，其臨床治療效果并不理想，因而探索高效低毒的抗肝癌藥物一直是熱點(diǎn)問題。近年來研究[1-3]發(fā)現(xiàn)：輪葉黨參(Codonopsislanceolata)中含有皂苷、黃酮類、生物堿類、三萜類化合物、植物甾醇類及揮發(fā)油類等藥用成分。輪葉黨參藥理學(xué)研究[4-5]表明：其具有抗突變、抗疲勞、抗氧化作用。本文作者前期研究[6-7]結(jié)果表明：輪葉黨參總皂苷能明顯誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG-2的凋亡，發(fā)酵輪葉黨參乙醇提取物明顯提高清除自由基的能力。為了明確輪葉黨參抑制肝癌細(xì)胞生長并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的活性成分及其作用機(jī)制，本研究從輪葉黨參中分離出黨參皂苷D(lancemaside D)，探討其對HepG-2細(xì)胞增殖的時(shí)間效應(yīng)和細(xì)胞周期的影響。關(guān)于黨參皂苷D體外抑制肝癌細(xì)胞增殖及其作用機(jī)制方面的研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器輪葉黨參采集自吉林省安圖縣。采用溶劑萃取和柱色譜方法分離純化黨參皂苷D，根據(jù)理化性質(zhì)和波譜學(xué)數(shù)據(jù)鑒定其結(jié)構(gòu)，見圖1。DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，特級(jí)胎牛血清(北京華美生科生物技術(shù)有限公司)，MTT粉劑(Sigma公司)，細(xì)胞周期檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。所用儀器有CO2培養(yǎng)箱(Sanyo公司)、流式細(xì)胞儀(美國BD公司)及酶聯(lián)免疫檢測儀(南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)。人肝癌細(xì)胞HepG-2由延邊大學(xué)腫瘤研究中心惠贈(zèng)。

1.2 細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn)取對數(shù)生長期的HepG-2細(xì)胞，配成細(xì)胞數(shù)為1×104mL-1的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每組設(shè)7個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，加入黨參皂苷D，終濃度達(dá)25 mg·L-1。在37℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)12、24、48和72 h后加入MTT溶液(5 g·L-1)，孵育4 h。吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO，低速震蕩10 min，用酶標(biāo)儀于492 nm波長處測其光密度(A)值，并計(jì)算細(xì)胞生長抑制率，細(xì)胞生長抑制率(%)=(對照組平均A值-實(shí)驗(yàn)組平均A值)/ 對照組平均A值×100%。

圖1 黨參皂苷D結(jié)構(gòu)式

1.3 繪制細(xì)胞生長曲線取對數(shù)生長期的HepG-2細(xì)胞，配成細(xì)胞數(shù)為1×104mL-1的單細(xì)胞懸液，接種于24孔板，2 mL/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。貼壁后加入不同濃度(5、10、15、20和25 mg·L-1)黨參皂苷D，每隔24 h取出，用臺(tái)盼藍(lán)拒染法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，每孔計(jì)數(shù)5次，取平均值。連續(xù)計(jì)數(shù)5 d。最后根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，以單位細(xì)胞數(shù)(×104mL-1)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 檢測細(xì)胞周期的變化取對數(shù)生長期HepG-2細(xì)胞，配成細(xì)胞數(shù)為1×106mL-1的單細(xì)胞懸液，接種于6孔板，每孔5 mL，每組設(shè)5個(gè)平行樣本，貼壁后加入不同濃度(5、10、15、20和25 mg·L-1) 黨參皂苷D培養(yǎng)72 h。小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液和貼壁細(xì)胞，加入1 mL預(yù)冷70%乙醇中，輕輕吹打混勻，4℃固定過夜。1 000 g離心3～5 min，沉淀細(xì)胞，用1 mL 預(yù)冷的PBS洗滌后，用碘化丙啶染色液染色后上機(jī)檢測。

2 結(jié) 果

2.1 黨參皂苷D作用后HepG-2細(xì)胞增殖抑制率的變化MTT法結(jié)果顯示：加入終濃度為25 mg·L-1的黨參皂苷D培養(yǎng)12、24、48和72 h后，細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。12～48 h內(nèi)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖抑制率逐漸增高。見表1。

表1 黨參皂苷D作用后HepG-2細(xì)胞增殖抑制率的變化

2.2 黨參皂苷D作用后HepG-2細(xì)胞總數(shù)的變化黨參皂苷D作用于HepG-2細(xì)胞24 h后，各個(gè)濃度組細(xì)胞總數(shù)與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；作用48、72、96 和120 h后，各個(gè)濃度組細(xì)胞總數(shù)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；黨參皂苷D 5、15、20及25 mg·L-1組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HepG-2細(xì)胞生長曲線見圖2。隨著黨參皂苷D濃度增加，HepG-2細(xì)胞增殖速度緩慢，表現(xiàn)為同一時(shí)間的活細(xì)胞數(shù)目隨著藥物濃度的增加而減少。

圖2 黨參皂苷D作用下HepG-2細(xì)胞的生長曲線

2.3 黨參皂苷D作用下HepG-2細(xì)胞周期的變化各濃度黨參皂苷D組G0/G1期細(xì)胞所占比例明顯高于對照組(P<0.05)，15 mg·L-1組與10 mg·L-1組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。25、20、15和10 mg·L-1組S期細(xì)胞所占百分比明顯低于對照組(P<0.05)。見表2和圖3(插頁二)。

表2 黨參皂苷D作用后HepG-2細(xì)胞周期時(shí)相的改變

3 討 論

輪葉黨參除了含有各種營養(yǎng)素之外，還含有豐富的皂苷、黃酮類、多酚類及多糖等化合物。輪葉黨參中的皂苷多為五環(huán)三萜類[8-9]，很多中草藥都含有五環(huán)三萜皂苷成分，如三七、遠(yuǎn)志等。其多以游離形式存在于自然界中，主要分為齊墩果烷型、烏蘇烷型、羽扇豆烷型和木栓烷型等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究[10-12]表明：五環(huán)三萜皂苷具有廣泛的藥理作用和抗腫瘤活性。

本研究結(jié)果表明：黨參皂苷D作用于HepG-2細(xì)胞48和72 h后均能抑制肝癌細(xì)胞的增殖，且作用48和72 h后各組細(xì)胞A值之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。黨參皂苷D作用下HepG-2細(xì)胞生長曲線的變化結(jié)果顯示：隨著黨參皂苷D加入量的提高細(xì)胞增殖抑制率增加，當(dāng)加入濃度達(dá)到20 mg·L-1時(shí)細(xì)胞倍增時(shí)間延長為4 d，對照組倍增時(shí)間為2 d，并且在其生長曲線中細(xì)胞未出現(xiàn)明顯的指數(shù)增長期，即曲線斜率未出現(xiàn)明顯的改變而出現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黨參皂苷D能很好地抑制肝癌細(xì)胞的增殖擴(kuò)散。

細(xì)胞周期分為兩個(gè)階段，即間期與分裂期。間期又分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)與DNA合成后期(G2期)。M期為細(xì)胞分裂期，G0期為暫時(shí)離開細(xì)胞周期，停止細(xì)胞分裂，去執(zhí)行一定生物學(xué)功能的細(xì)胞所處的時(shí)期[13-14]。很多腫瘤化學(xué)預(yù)防劑阻止了細(xì)胞中的紡錘絲的形成，從而抑制了細(xì)胞的有絲分裂，使細(xì)胞分裂停止于G0階段，有效地遏制了癌細(xì)胞的惡性增殖和擴(kuò)散。Eli等[15]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：吲哚美辛可以使S期及G2/M期的腫瘤細(xì)胞比例減少，而G1期細(xì)胞比例增加；孟憲瑛等[16]研究結(jié)果表明：80 μmol·L-1的Celecoxib作用于甲狀腺癌TT細(xì)胞48和72 h后，腫瘤細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，G2及S 期比例明顯減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黨參皂苷D作用于HepG-2細(xì)胞72 h后，G0/G1期細(xì)胞所占百分比明顯高于對照組，25、20、15和10 mg·L-1組S期細(xì)胞所占百分比明顯低于對照組，與Eli和孟憲瑛等的研究結(jié)果一致。在細(xì)胞分裂周期中G1期是決定細(xì)胞生長速度和細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，因此推測黨參皂苷D通過阻礙癌細(xì)胞DNA的合成而誘導(dǎo)凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黨參皂苷D在一定劑量范圍內(nèi)抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞增生，并呈劑量依賴性，使G0/G1期細(xì)胞比例增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。隨著黨參皂苷D作用機(jī)制的闡明，可能為肝癌的防治提供廣闊的應(yīng)用前景。

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