郭少娟，張中旺，張永光，王永錄，潘 麗，呂建亮，周 鵬

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046）

口蹄疫是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，以宿主范圍廣、傳染性強(qiáng)、傳播迅速著稱，因嚴(yán)重危害發(fā)病動(dòng)物的生產(chǎn)性能和畜產(chǎn)品質(zhì)量，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，極大地沖擊爆發(fā)國家的國際貿(mào)易，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類疾病。FMDV結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成病毒衣殼，識別特異性細(xì)胞受體，決定宿主范圍和組織嗜性，決定病毒抗原性等功能。結(jié)構(gòu)蛋白P1是主要的免疫保護(hù)性蛋白，通過原核表達(dá)P1蛋白，純化后免疫動(dòng)物制備多克隆血清，是一種研究結(jié)構(gòu)蛋白P1功能的有效工具。FMDV是單股RNA病毒，具有高頻率的核苷酸替代特性。FMDV的各種適應(yīng)毒的獲得是進(jìn)一步研究此毒特性、應(yīng)用的基礎(chǔ)，所以對適應(yīng)毒變異的鑒定是必要的[1]。研究對表達(dá)P1蛋白制備的多克隆兔抗及AsiaⅠ/HeB株FMDV在試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞上適應(yīng)后是否變異進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 病毒及主要試劑

FMDV HeB株由國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室毒種保藏中心提供，BHK-21細(xì)胞株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，RNeasy Mini Kit（Qiagen公司），Prime－Script＠ One Step RT-PCR Kit Ver 3.0（大連寶生物公司），膠回收試劑盒Wizard＠SV Gel and PCR Clean-UP System（Promega公司），滅活的口蹄疫病毒抗原由蘭州獸醫(yī)研究所馬軍武老師提供。2～3日齡乳鼠，300～400 g豚鼠由蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物廠提供。重組克隆載體pGEM-P1、多克隆兔抗由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中FMDV VP1基因序列及有關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)了1對引物，用于FMDV HeB株的VP1基因擴(kuò)增，引物由大連寶生物合成。

上游引物：5′-CACAAATGTACAGGGATGGGT-3′

下游引物：5′-GACATGTCCTCCTGCATCT-3′

1.3 病毒鑒定

FMDV HeB/MF7融化后，離心，參考RNeasy Mini Kit操作說明提取病毒基因組RNA。參考大連寶生物PrimeScript＠ One Step RT-PCR Kit Ver 3.0反轉(zhuǎn)錄病毒RNA，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，參考Promega的Wizard＠SV Gel and PCR Clean-UP System 回收RT-PCR產(chǎn)物。RT-PCR產(chǎn)物送大連寶生物測序。測序結(jié)果數(shù)據(jù)庫BLAST比對和DNAstar分析。

1.4 病毒復(fù)壯

FMDV HeB/MF7融化后，背部皮下注射2～3日齡乳鼠，每只0.2 mL。FMDV致死的乳鼠胴體用乳白液洗凈，無菌濾紙吸干水分，稱重。在研缽中研磨，用 MEM/EBSS（加雙抗）進(jìn)行 1∶4稀釋，4℃過夜浸毒，4 000 r/min離心10 min，上清液接種乳鼠，方法同上。按照上述方法連續(xù)傳代2次，乳鼠致死時(shí)間穩(wěn)定，收集MF9代乳鼠毒，－70℃保存?zhèn)溆茫野床《捐b定中的方法對MF9代乳鼠毒是否發(fā)生變異進(jìn)行鑒定。

1.5 病毒細(xì)胞毒

FMDV HeB/MF9取4 mL左右，加入1/2體積的氯仿，搖蕩10 min，3 000 r/min離心20 min，取上清液裝入另一試管中，4℃過夜揮發(fā)氯仿后，接種已形成單層且形態(tài)正常的BHK-21細(xì)胞，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察記錄細(xì)胞病變。連續(xù)傳代至致細(xì)胞病變時(shí)間穩(wěn)定，將細(xì)胞毒－70℃凍存?zhèn)溆?，?biāo)記為FMDV HeB/CF13，且按上述病毒鑒定方法對CF13代細(xì)胞毒進(jìn)行鑒定。

1.6 病毒豚鼠毒

豚鼠后肢跖部皮內(nèi)穿刺接種FMDV HeB/MF9，第1次接種就產(chǎn)生水皰，采集水皰皮，剪碎液氮研磨，MEM/EBSS（加雙抗）稀釋。4℃過夜浸毒，4 000 r/min離心10 min，上清液連續(xù)接種3代，－70℃保存?zhèn)溆?，?biāo)記為 FMDV HeB/GP3，且按上述病毒鑒定方法對GP3代豚鼠毒進(jìn)行鑒定。

1.7 多克隆抗體

從重組克隆載體pGEM-P1中擴(kuò)增編碼P1特異性蛋白的基因片段，并克隆入原核表達(dá)載體pET-28a（+）中。通過優(yōu)化表達(dá)條件，誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)P1蛋白。P1蛋白包涵體進(jìn)行SDS-PAGE，凝膠上切下目的條帶，透析純化，與等體積的弗氏佐劑乳化，背部多點(diǎn)注射3月齡健康新西蘭兔，2周后與等體積的不完全弗氏佐劑乳化進(jìn)行首次加強(qiáng)免疫，隔1周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫3次后1周經(jīng)心臟大量采血，分離抗血清。健康對照組同時(shí)采血分離血清。－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 多克隆抗體鑒定

用滅活的FMDV抗原進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，1×PBST配制的5%的脫酯奶粉搖床上封閉2 h，1×PBST漂洗膜3次，將PVDF膜剪成兩份，分別放入用封閉液按1∶500稀釋的FMDV制備的多克隆兔抗血清和健康對照組分離的血清，室溫孵育1 h，用1×PBST漂洗膜，加入10 mL DAB顯色液，避光顯色，待出現(xiàn)目的條帶后立即用去離子水終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。

1.9 多克隆抗體效價(jià)的測定

用滅活的FMDV抗原包被96孔的聚苯乙烯ELISA反應(yīng)板，間接ELISA法測定抗體效價(jià)。0.05 moL/L的碳酸鹽緩沖液（pH值 9.6）稀釋FMDV豚鼠抗血清至工作濃度1∶300，在ELISA板上每孔加50 μL，振蕩，封膜封板，室溫過夜，棄去包被液，1×PBST洗板 5～6次，拍干 ELISA 板，200 μL 5%脫酯奶粉37℃封閉2 h，洗板，然后每孔加入50 μL用1×PBST 稀釋的待測多抗血清，從 1∶25 至 1∶51 200倍比稀釋，同時(shí)將健康對照組分離的血清稀釋成1∶500和1∶1 000做陰性對照，37℃放置l h，洗板甩干。每孔分別加入50 μL已用1×PBST稀釋的山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物（1∶300稀釋），37℃放置l h，每孔分別加入50 μL新鮮配制的OPD應(yīng)用液（務(wù)必加雙氧水），37℃顯色15 min，50 μL的濃H2SO4終止液，終止顯色，立即用酶標(biāo)讀數(shù)儀，在492 nm波長下讀取光吸收值（OD492nm值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒鑒定

提取FMDV RNA后，用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳圖1，可見擴(kuò)增條帶與預(yù)期目的基因FMDV VP1的大小相符。將擴(kuò)增的基因片段膠回收純化，測序，結(jié)果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中 BLAST，選擇 Asia1/jiangsu/CHA/2005（EF149009），Asia1/HeB/CHA/1/2005（EF18727 4）的VP1序列DNAstar分析，結(jié)果如圖2，此毒與Asia1/jiangsu/CHA和Asia1/HeB/CHA同源性達(dá)到98.7%以上。RT-PCR電泳及測序比對結(jié)果顯示，國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室毒種保藏中心提供的HeB/MF7屬口蹄疫病毒AsiaⅠ型江蘇普系毒株，較其親本毒，與AsiaⅠ/jiangsu/China/05同源性較高。

圖1 FMDV AsiaⅠ/HeB/MF7 VP1擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 VP1序列比對結(jié)果

2.2 不同宿主適應(yīng)毒的鑒定

同上述病毒鑒定中的方法相同，從傳代乳鼠毒、細(xì)胞毒、豚鼠毒中提取病毒基因組，反轉(zhuǎn)錄病毒RNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳目的條帶都與預(yù)期大小相符，約886 bp（圖3、圖4）。目的條帶回收，測序。通過DNAstar軟件對測序與提供的原毒及這3種適應(yīng)毒進(jìn)行比對，結(jié)果如圖5。

圖3 乳鼠FMDV-VP1擴(kuò)增產(chǎn)物

圖4 細(xì)胞和豚鼠FMDV-VP1擴(kuò)增產(chǎn)物

圖5 VP3序列比對結(jié)果

結(jié)果表明病毒在不同的宿主傳代適應(yīng)后與原毒VP1基因序列同源性都大于98%。在乳鼠連傳2代后VP1基因核苷酸序列同源性為98.6%，乳鼠毒在BHK-21細(xì)胞上連傳13代后VP1基因核苷酸序列同源性為99.5%，乳鼠毒在豚鼠連傳3代后VP1基因核苷酸序列同源性為100%。根據(jù)同一血清型口蹄疫病毒基因型劃分，此3種適應(yīng)毒為遺傳關(guān)系高度密切的同一基因亞型。

2.3 多克隆抗體Western Blot及ELISA抗體效價(jià)

FMDV抗原SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)膜，對多克隆兔抗及健康對照血清進(jìn)行Western Blot。

結(jié)果如圖6，P1蛋白制備的多克隆兔抗與FMDV抗原形成了特異的抗原抗體反應(yīng)帶。間接ELISA法測定多克隆兔抗的效價(jià)，結(jié)果判定其效價(jià)＞1∶800。

圖6 抗體與FMDVAsiaⅠ標(biāo)準(zhǔn)抗原的Western blot反應(yīng)

3 討論

FMDV在流行過程中易受外界因素的影響，特別是易感動(dòng)物免疫壓力的影響，病毒的毒力和抗原性都易發(fā)生變異。選擇壓力主要作用于抗原位點(diǎn)因此病毒的變異也主要發(fā)生在編碼這些位點(diǎn)的基因組序列中。不同分離株之間甚至同一毒株的不同代次之間都存在明顯的核苷酸差異[1]。鄭海學(xué)等[2]通過對Asia1型FMDV的1D序列分析證實(shí)，田間含有RDD毒株（RGD中的 G突變?yōu)?D）的細(xì)胞感染力和乳鼠致病力比田間含有RGD毒株的高10倍左右。鄭海學(xué)等[3]對Asia1型FMDV豬源毒株和牛源毒株的全基因比較分析表明，主要差別是豬源毒株Asia1/HN/06在主要抗原位點(diǎn)變?yōu)镽DD和155位置的N變?yōu)镾或D。Martinez等[4]用同一 FMDV分離株在不同的時(shí)間結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了具有不同核苷酸序列的變異毒株。Dela Torre等[5]在 BHK-21細(xì)胞系上建立了C型FMDV的持續(xù)感染，并從中分離病毒對其基因組與其祖代毒株的基因組進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)后代病毒基因組在逐漸發(fā)生變異。適應(yīng)毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1序列的穩(wěn)定是應(yīng)用此毒對疫苗免疫效果評價(jià)可信的因素之一。

FMDV P1基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白是構(gòu)成FMDV衣殼的基礎(chǔ)，結(jié)構(gòu)蛋白P1具有很好的抗原性，包含了FMDV的主要抗原位點(diǎn)，對誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和其他保護(hù)性免疫反應(yīng)有重要作用。通過FMDV抗原對P1蛋白制備的多克隆兔抗的鑒定是下一步應(yīng)用此多抗的基礎(chǔ)。Sanz P A等[6]在P1重組腺病毒免疫?？刹糠直Ｗo(hù)口蹄疫感染之后，用P1重組腺病毒及P1重組痘病毒免疫豬也獲得了免疫保護(hù)。牟偉鋒等[7]用構(gòu)建的含有AsiaⅠ型FMDV衣殼蛋白前體P1-2A基因的真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生了特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。張中旺等[8]應(yīng)用P1制備的多克隆血清篩選結(jié)構(gòu)蛋白上預(yù)測的B細(xì)胞表位。

本研究對AsiaⅠ/HeB株FMDV在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物乳鼠，豚鼠和FMDV培養(yǎng)常用細(xì)胞BHK-21獲得的適應(yīng)毒應(yīng)用RT－PCR技術(shù)擴(kuò)增VP1基因，測序比對確定其核酸序列同源性高達(dá)98%以上，主要抗原位點(diǎn)未發(fā)生變異，可進(jìn)一步應(yīng)用到疫苗研究中。并應(yīng)用Western blot對表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白P1制備的多克隆兔體進(jìn)行了鑒定，確定此多抗能中和FMDV結(jié)構(gòu)蛋白，間接ELISA方法確定了抗體效價(jià)＞1∶800。

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