范亞麗 ，李 進(jìn)，阮 穎，劉春林

（1.阜陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2.新疆建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)一師十三團(tuán)，

新疆 阿克蘇 843302；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 412328）

高致病力禽流感（High pathogenic avian fluenza，HPAI）是由A型流感病毒中的一些H5和H7亞型病毒引起的具有高度傳染性、危害機(jī)體多種器官、高死亡率的禽類的一種系統(tǒng)性疾病，已被國際獸疫局列為A類烈性傳染病[1-3]。自1905年禽流感病原被確認(rèn)后，世界上共暴發(fā)了18次HPAI，其中8次是由H5亞型、10次是由H7亞型HPAIV引起的，給養(yǎng)禽業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。禽流感病毒屬正粘病毒科流感病毒屬的A型流感病毒，基因組由8個(gè)分節(jié)段單股負(fù)鏈RNA組成，編碼至少10種蛋白質(zhì)[5]。第6節(jié)段RNA編碼的神經(jīng)氨酸酶（NA）是病毒囊膜表面的一種糖蛋白，其主要作用是水解細(xì)胞表面受體糖蛋白末端的N2乙?；窠?jīng)氨酸，以利于子代病毒的成熟和轉(zhuǎn)移[6]。NA是誘導(dǎo)體液免疫的靶抗原之一，通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，抑制病毒從感染細(xì)胞中釋放，降低病毒在體內(nèi)的復(fù)制，進(jìn)而產(chǎn)生抗病毒作用[7]。用NA基因構(gòu)建的DNA疫苗免疫動(dòng)物，能誘導(dǎo)抗流感病毒致死攻擊的免疫保護(hù)[8]。

生菜（Lactuca sativa var.capatata L.）為菊科萵屬植物，是一種由國外引進(jìn)的生食蔬菜，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，生長周期短，苣整株可以生食，再生和轉(zhuǎn)化率較高，是一種用來表達(dá)外源蛋白的良好宿主植物。筆者采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有禽流感抗原基因NA的表達(dá)載體導(dǎo)入外植體生菜，初步研究了禽流感抗原基因NA在生菜基因組中的表達(dá)，旨在為以生菜作為植物生物反應(yīng)器應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)異源蛋白或疫苗提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 生菜（Lactuca sativa var.capatata L.），品種：玻璃生菜（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因工程實(shí)驗(yàn)室）。

1.1.2 菌株和載體 含目的DNA片段表達(dá)載體pBI121-NA的農(nóng)桿菌菌株：Agrobacterium tumefaciens LBA4404。表達(dá)載體pBI121-NA由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)作物基因工程實(shí)驗(yàn)室提供，李進(jìn)[9]構(gòu)建。表達(dá)載體pBI121-NA結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 表達(dá)載體pBI121-NA結(jié)構(gòu)

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得 選取顆粒飽滿的玻璃生菜種子，先用75%酒精浸泡30 s，再用40 mL 5%NaClO加入2滴吐溫溶液浸泡15 min，無菌水沖洗3～5次，將種子均勻播種于1/2 MS培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿200粒，置于25℃光照培養(yǎng)，2～3 d獲得培養(yǎng)一致的無菌苗。

1.2.2 農(nóng)桿菌工程菌的準(zhǔn)備 取攜帶pBI121-NA質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404單菌落接種于3～5 mL含Kan、Str和Rif 3種抗生素YEB液體培養(yǎng)基中，于28℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；取培養(yǎng)液1 mL加入到含3種抗生素的50 mLYEB液體培養(yǎng)基中，28℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)4 h；測量菌液濃度OD600值，選取合適濃度的菌液4℃、5 000 r/min離心10 min，收集菌體，棄去上清液，用50 mL滲透液體培養(yǎng)基重懸菌體，備用。

1.2.3 子葉浸染轉(zhuǎn)化 將生長2～3 d的生菜，利用子葉浸染轉(zhuǎn)化法進(jìn)行生菜的遺傳轉(zhuǎn)化。在重懸的菌液中加入0.05%β-巰基乙醇和100 mmol/L的AC混勻；然后用子葉放進(jìn)OD600值為0.4～0.6菌液中浸染15 min，平放到共培養(yǎng)基上共培3 d；轉(zhuǎn)入到誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，兩周后，將分化出的芽轉(zhuǎn)移到苗生長培養(yǎng)基上，兩周壯苗后，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基；待苗長出發(fā)達(dá)的根系時(shí)，打開封口膜1 d，再將幼苗轉(zhuǎn)入到蛭石固體培養(yǎng)基中煉苗一周；一星期后移栽到營養(yǎng)土中，移栽苗生長期間每3 d澆1次1/10 MS營養(yǎng)液，再經(jīng)15 d左右移入大田。

1.2.4 轉(zhuǎn)化植株的檢測 （1）PCR擴(kuò)增檢測：根據(jù)目的片段的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增481 bp的序列，引物序列如下。

NA_FB：5′-GAAGATCTTCATGAATCCAAATC AGAAGATAACAACCAT-3′

NA_RM：5′-CTCATTAATGTTCTGTGAGGGCT TCTG-3′

PCR反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 4 min；94℃變性 40 s；60℃退火 40 s；72℃延伸120 s，共35個(gè)循環(huán)。72℃延伸7 min，16℃保存。

（2）RT-PCR檢測：以未轉(zhuǎn)基因的生菜葉片，轉(zhuǎn)基因生菜葉片為材料，用RNA提取試劑盒進(jìn)行生菜總RNA的提取，用Pronege DNAse試劑盒消化總RNA中含有的DNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別以未轉(zhuǎn)基因生菜葉片、轉(zhuǎn)基因生菜葉片、未檢測到目的片段的抗性生菜的反轉(zhuǎn)錄后cDNA、含目的片段DNA以及水為模板，以NA_FB，NA_FM為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

2.1 卡那霉素和頭孢霉素對(duì)生菜子葉分化能力的影響

生菜對(duì)卡那霉素（Kan）有一定的抗性，Kan對(duì)不定芽的誘導(dǎo)影響較大，明顯表現(xiàn)出對(duì)生菜子葉分化的抑制作用，隨Kan濃度升高，不定芽的誘導(dǎo)率以及平均出芽數(shù)逐漸降低。圖2結(jié)果顯示，當(dāng)Kan濃度為80 mg/L時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)率由對(duì)照的100%降低到85.4%，開始影響子葉的分化，平均出芽數(shù)由5.43個(gè)降低到2.85個(gè)；當(dāng)Kan濃度達(dá)到100 mg/L時(shí)，不定芽的誘導(dǎo)和出芽數(shù)也大幅度減少；當(dāng)Kan濃度為120 mg/L時(shí)，完全抑制生菜不定芽的誘導(dǎo)。因此，選擇Kan 120 mg/L為誘導(dǎo)分化的篩選濃度。頭孢霉素（Cef）對(duì)生菜植株的再生的抑制作用不是很明顯，但仍然表現(xiàn)為隨著抗生素濃度的提高，不定芽的誘導(dǎo)率逐漸降低，表明生菜對(duì)頭孢霉素的抗性仍然能達(dá)到400 mg/L。因此，可以使用Cef作為農(nóng)桿菌的生長抑制劑。

圖2 抗生素對(duì)生菜子葉再生的影響

2.2 頭孢霉素對(duì)生菜轉(zhuǎn)化的影響

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化生菜的過程中，抑菌是轉(zhuǎn)化是否成功的一個(gè)關(guān)鍵因素[10]。圖3結(jié)果表明：頭孢霉素對(duì)生菜本身的選擇壓不明顯，但隨著抗生素濃度的提高，不定芽的誘導(dǎo)率逐漸降低，可選擇頭孢霉素抑制農(nóng)桿菌生長達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康?。Cef濃度為50 mg/L時(shí)，抑菌率為58%；Cef濃度達(dá)到100 mg/L時(shí)，抑菌率為100%，當(dāng)抑菌劑濃度更高時(shí)，抑菌率均達(dá)到100%。試驗(yàn)確定Cef的抑菌濃度為100 mg/L。

2.3 轉(zhuǎn)基因生菜的檢測

圖3 頭孢霉素對(duì)生菜轉(zhuǎn)化的影響

2.3.1 抗性苗的PCR檢測 把得到的抗性苗提取DNA作為模板，用2對(duì)篩選引物做PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖4所示：1～14泳道為提取DNA作為模板擴(kuò)增結(jié)果，其中15泳道為對(duì)照（非轉(zhuǎn)化植株），16泳道為質(zhì)粒陽性對(duì)照，陽性植株的目的片段大小為481 bp，擴(kuò)增帶與預(yù)期大小相符。說明1、6、14泳道為轉(zhuǎn)基因苗。圖4中以不同轉(zhuǎn)基因植株總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各帶亮度不一，可能是受DNA提取純度或基因在植物中的拷貝不同的影響。

圖4 卡那霉素抗性苗的PCR檢測

2.3.2 轉(zhuǎn)基因生菜總RNA的提取 用試劑盒將總RNA抽提完成后，用紫外熒光光度計(jì)測定OD260和OD280，結(jié)果OD260/OD280為1.9，表明所提取的總RNA純度較高。取10 μg RNA在無RNA酶的1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖5所示，1泳道為轉(zhuǎn)基因生菜總RNA，2泳道為未轉(zhuǎn)基因生菜總RNA。從圖中可以看出1、2泳道中RNA樣品沒有降解，完全符合進(jìn)行做反轉(zhuǎn)錄的要求。

圖5 生菜總RNA的瓊脂糖凝膠電泳

2.3.3 轉(zhuǎn)基因生菜RT-PCR檢測 分別以轉(zhuǎn)基因生菜葉片、未轉(zhuǎn)基因生菜葉片、未檢測到目的片段的抗性生菜反轉(zhuǎn)錄后的cDNA、含目的片段DNA以及水為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖6）。研究結(jié)果表明：5泳道為以含目的片段DNA為模板作陽性對(duì)照，其擴(kuò)增產(chǎn)物大小為481 bp的條帶，與marker相比較，目的片段位于300～500 bp之間，約481 bp，條帶大小與預(yù)期的一致。1泳道為以轉(zhuǎn)基因生菜反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物為長約481 bp的特異性DNA片段，與陽性對(duì)照片段大小一致。2、3泳道分別為以未轉(zhuǎn)基因生菜和未檢測到目的片段的抗性生菜反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，4泳道以水為模板作陰性對(duì)照，均沒有得到與陽性對(duì)照片段大小一致的條帶。這說明目的片段只在轉(zhuǎn)基因植株中檢測到，而沒有在未轉(zhuǎn)基因植株中檢測到目的片段，證明目的基因已經(jīng)整合到生菜基因組中。

圖6 轉(zhuǎn)基因苗的RT-PCR檢測

3 討論

隨著植物生物技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)外源蛋白或可食性疫苗已成為一個(gè)重要的研究和開發(fā)領(lǐng)域。植物生物反應(yīng)器是指通過基因工程途徑，以常見的農(nóng)作物作為“細(xì)胞工廠”，通過大規(guī)模種植生產(chǎn)具有高附加值的醫(yī)用蛋白、疫苗、工農(nóng)業(yè)用酶、特殊碳水化合物等植物反應(yīng)器[11]。其最大的優(yōu)點(diǎn)是可以大規(guī)模、廉價(jià)、安全地生產(chǎn)動(dòng)物蛋白或疫苗[12]，特別是用于免疫和治療性疫苗的生產(chǎn)，已隨著研究的深入越來越顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢[13]。基因工程領(lǐng)域的研究進(jìn)展，使得植物體正在成為具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的異源蛋白（包括藥用蛋白）的生產(chǎn)體系。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，迄今為止，國外已經(jīng)有幾十種藥用蛋白質(zhì)或多肽在植物中得到成功表達(dá)，其中包括了人的細(xì)胞因子、表皮生長因子、促紅細(xì)胞生成素、干擾素、生長激素、單克隆抗體和可作為疫苗用的抗原蛋白等[14]。

筆者通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化生菜，已經(jīng)獲得卡那霉素抗性苗105株，用特異引物對(duì)抗性植株進(jìn)行PCR檢測，其中6株為轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)RT-PCR檢測可知，禽流感抗原基因NA已經(jīng)在生菜基因組中得到整合并初步驗(yàn)證在轉(zhuǎn)錄水平上得以表達(dá)。通過陽性株的無性繁殖可以擴(kuò)大陽性植株的數(shù)量，為禽流感抗原基因NA在生菜中的表達(dá)、編碼蛋白免疫原性以及能否在后代中穩(wěn)定遺傳的研究打下基礎(chǔ)。

[1]黃慶華，張果平，王 可.禽流感病毒NP蛋白單克隆抗體的研制和鑒定[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22（12）：141-143.

[2]于 博，章振華，姜北宇，等.一株H9N2亞型禽流感病毒全基因組序列的遺傳變異分析 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（1）：507-509，526.

[3]Shen J，Zhang Z H，Jiang B Y，et al.Complete genome sequencing and genetic variation analysis of two H9N2 subtype avian influenza virus strains[J].Agricultural Science&Technology，2011，12（2）：291-294.

[4]Tang X Y，Tian G B，Zhao C S，et al.Isolationand characterization of prevalent strains of avian influenza viruses in China[J].Chinese Journal Animal Poultry Infection Disease，l998，20（1）：l-5.

[5]Alexander D J.A review of Avian Influenza in Different Bird Speices[J].Veterinary Micorbiology，2000，74：3-13.

[6]Palese P ，Tobita K，Ueda M ，et al.Characterization ofTemperature Sensitive Influenza Virus Mutants Defective in Neuraminidae[J].V i rology，1974，61：397-410.

[7]Webster R G，Reay P A ，Laver W G.Protection against Lethal Influenza with Neuraminidase[J].Virology，1988，164：230-237.

[8]Sandbulte M R ，J imenez G S ，Boon A C M ，et al.Cross-Reactive Neuraminidase Antibodies Afford Partial Protection against H5N1 in Mice and Are Present in Unexposed Humans[J].PLOS Medicine，2007，4：265-271.

[9]李 進(jìn)，阮 穎，龔 劍，等.禽流感抗原基因NA，HA的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，8（3）：449-452.

[10]莽克強(qiáng).農(nóng)業(yè)生物工程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1998.

[11]Oersbo M，Okkels F T.A novel principle for the selection of transgenic plant cells：positive selection[J].Plant Cell Reports，1996，16：219-221.

[13]Hiatt A，Cafferkey R，Bowdish B.Production of antibodies in transgenetic plants[J].Nature，1989，342：76-78.

[13]Tacket C O，Mason H C，Losonsky G，et al.Immunogenicity in humans of a recombinant bacterial antigen delivered in a transgenic potato[J].Nature Medicine，1998，5（4）：607-609.

[14]Mason H S，Ball J M，Shi J J，et al.Expression of hepatitis B surface antigen in transgenic plants[J].Proc Natl Acad Sci USA，1992，89：11745-11749.