沈繼紅，宋維志，林學(xué)政，王 帥，Dewi Seswita Zilda

（1.國家海洋局 第一海洋研究所，山東 青島 266061；2.國家海洋局 海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266061；3.印度尼西亞海洋與漁業(yè)研究局 海洋生物技術(shù)與水產(chǎn)品加工研究中心，雅加達(dá) 999006）

極端生境微生物資源的研究與開發(fā)已發(fā)現(xiàn)了豐富特殊的嗜熱菌和超嗜熱菌。嗜熱菌／超嗜熱菌不僅具有很高的最高生長溫度（maximum temperature of growth，Tmax），而且具有很高的最低生長溫度（minimum temperature of growth，Tmin）［1］。熱泉和熱液口生態(tài)系統(tǒng)生存著許多嗜熱／超嗜熱微生物，其中部分菌株可在高達(dá)110°C的條件下，以各種各樣的代謝方式厭氧或好氧生長［2］。對熱耐受性最強(qiáng)的生物是形態(tài)像細(xì)菌的單細(xì)胞生物，稱為古菌（以前叫古細(xì)菌）。古菌和細(xì)菌的不同之處在于其細(xì)胞膜脂類的化學(xué)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁和核糖體的結(jié)構(gòu)及其對抗生素的生長敏感性［1，3］。古菌域分為廣古菌門（Euryarchaeota）、泉古菌門（Crenarchaeota）、初古菌門（Korarchaeota）和納古菌門（Nanoarchaeota）。古菌研究起步較晚，由于缺乏足夠的純培養(yǎng)物和16SrRNA基因的序列信息，目前初古菌門和納古菌門的分類地位還不能完全確定，研究相對普遍的是泉古菌門和廣古菌門［4］。

古菌具有在各種極端生境，如極高溫、高鹽、極低酸性pH等條件下生存與繁殖的能力，是目前生物地球化學(xué)循環(huán)研究的熱點(diǎn)之一［5］。實(shí)際上，最近的分子生態(tài)學(xué)研究表明，該原核域的生命是無處不在的，它不僅可以在各種極端條件下生存，在普通海洋環(huán)境中也廣泛存在［6－12］。除了生活在美國黃石公園熱泉和西伯利亞永久性凍土等極端生境外，古菌在每一種生境，從花園土壤到口腔，從珊瑚礁到人類腸道中幾乎均可以被發(fā)現(xiàn)［5］。在自然界的高溫環(huán)境中，熱泉、sulfatara和地?zé)嵬寥朗亲钇胀ê鸵走_(dá)的生境。由于其巨大的豐富性，古菌在地球的生物地球化學(xué)循環(huán)過程中發(fā)揮著重要的作用［5，13－14］。

已利用免培養(yǎng)的分子系統(tǒng)發(fā)育分析技術(shù)對不同熱液生態(tài)系統(tǒng)的微生物多樣性進(jìn)行了研究［15－17］。然而，關(guān)于陸地?zé)崛蜕詈嵋嚎诘奈⑸锒鄻有约捌湓谏锏厍蚧瘜W(xué)循環(huán)中作用的認(rèn)識(shí)仍顯不足。本研究擬利用基于16SrRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育技術(shù)對印度尼西亞蘇門答臘島Padang Cermin熱泉的古菌多樣性進(jìn)行研究，并與其他熱泉進(jìn)行比較分析，以期了解該地區(qū)熱泉的古菌多樣性。

1 材料與方法

1.1 樣 品

熱泉泥樣于2009－10－20采自印度尼西亞蘇門答臘島 Padang Cermin熱泉（5°37′59″N，105°04′20″E）。樣品采集點(diǎn)的溫度和pH分別為97℃和6.7。樣品用無菌瓶儲(chǔ)存，并存放于冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室后4℃貯存。

1.2 環(huán)境基因組DNA的提取

采用土壤DNA快速提取試劑盒（Spin－column，DP4001，Bioteke，北京）按照說明書對環(huán)境基因組DNA進(jìn)行提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)提取環(huán)境基因組的完整性。

1.3 古菌16SrRNA基因的擴(kuò)增及其文庫的構(gòu)建

采用通用引物（21F：5′－TTCCTTGGGATCCYGCCGGA－3′，958R：5′－YCCGGCGTTGAMTCCAATT－3′）擴(kuò)增古菌16SrRNA基因，PCR條件參照文獻(xiàn)［10］。

擴(kuò)增到的16SrRNA基因經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段（約950bp），純化的PCR產(chǎn)物連接到T載體pMD18－T（D101，Takara，大連）并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coliDH5α。在含有Amp、ITTG和X－gal的LB平板上挑取白色菌落即為陽性克隆。

1.4 16SrRNA基因的限制性酶切分析

利用質(zhì)粒pMD－18T的特異性引物RV－M （D3880，Takara）和 M13－47（D3887，Takara）從陽性克隆中PCR擴(kuò)增插入的古菌16SrRNA基因。PCR產(chǎn)物（約1 000bp）經(jīng)純化后先用限制性內(nèi)切酶AluⅠ酶切，具有相同酶切圖譜的再用限制性內(nèi)切酶MspⅠ 酶切。具有相同AluⅠ和MspⅠRFLP酶切圖譜的克隆即被認(rèn)為屬于同一個(gè)操作分類單位（operational taxonomic unit，OTU）［18］。

1.5 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

每個(gè)OTU選取1個(gè)代表性克隆進(jìn)行古菌16SrRNA基因的序列測定與分析，分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析參照文獻(xiàn)［19］。

1.6 群落結(jié)構(gòu)分析

熱泉古菌群落結(jié)構(gòu)分析所采用的方法與指數(shù)參照文獻(xiàn)［18，20］。

1.7 16SrRNA基因序列注冊號(hào)

本研究報(bào)道的未培養(yǎng)古菌16SrRNA基因的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，獲得注冊號(hào)分別為HQ317327－HQ317340。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆文庫的RFLP分析與16SrRNA基因的序列分析

從構(gòu)建的Padang Cermin熱泉古菌16SrRNA基因文庫中選取經(jīng)PCR驗(yàn)證的含目標(biāo)基因片段（約950 bp）的62個(gè)陽性克隆進(jìn)行進(jìn)一步分析（RFLP分析），得到10個(gè)具有不同AluⅠ酶切圖譜的類群；含有1個(gè)以上克隆的7個(gè)類群再用限制性內(nèi)切酶MspⅠ酶切，得到了11種MspⅠ酶切圖譜特征。具有相同AluⅠ和MspⅠ的RFLP酶切圖譜的克隆即屬于同一個(gè)OTU，因此從62個(gè)陽性克隆中共得到14個(gè)OTUs（表1）?？寺?shù)最多的OUT種類，即OTU2和OTU1，分別占總檢測克隆數(shù)的27.42% 和20.96%，表明該兩個(gè)類群在Padang Cermin熱泉古菌群落中占優(yōu)勢地位。6個(gè)OTU種類，即OTU7－OTU9和OTU12－OTU14只含有1個(gè)克隆，占總OTUs的42.88%。從每個(gè)OTU中選取1個(gè)代表性克隆進(jìn)行古菌16SrRNA基因插入片段的序列測定與分析。

從每個(gè)OTU中選取1個(gè)代表性克隆進(jìn)行測序，獲得長度約為950bp的古菌16SrRNA基因序列（表1），與Padang Cermin熱泉古菌代表性克隆相似性最高的古菌16SrRNA基因序列見表1。相似性分析表明，Padang Cermin熱泉古菌的16SrRNA與龐大的GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的rRNA序列的相似性均高于91%；有些OTU與其他熱泉未培養(yǎng)的古菌16SrRNA的相似性可達(dá)97%，表明它們可能屬于同一個(gè)屬的不同種；其中有3個(gè)OTU（OTU9、OTU11和OTU14）具有較低的相似性（＜93%）表明它們可能屬于新屬甚至是新科。

表1 印尼Padang Cermin熱泉古菌16SrRNA基因序列同源性比較Table 1 Homological analysis of 16SrRNA gene of archaea collected from hot spring in Padang Cermin，Indonesia

2.2 群落結(jié)構(gòu)分析

理論上，克隆文庫的庫容表征樣品中微生物種類的覆蓋程度［18］。Padang Cermin熱泉古菌群落結(jié)構(gòu)分析如表2所示?？梢钥闯?，本研究所構(gòu)建的熱泉古菌16SrRNA克隆文庫的庫容Coverage（C）值為90.32%，表明該文庫的覆蓋程度較高，能比較真實(shí)地代表該熱泉的微生物的多樣性［6，18］。較低的Shannon－Wiener指數(shù)（3.11）和豐富度指數(shù)（2.18）表明，該熱泉的古菌多樣性較低，而較高的Simpson指數(shù)則表明，該熱泉具有較強(qiáng)的優(yōu)勢菌群，這與該熱泉古菌16SrRNA基因文庫的PCR－RFLP分析結(jié)果相一致。

表2 古菌16SrRNA基因克隆文庫酶切類型的多樣性Table 2 Diversity of restriction endonuclease types in the archaeal 16SrRNA gene clone library

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

圖1 Padang Cermin熱泉古菌的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the archaea collected from the hot spring in Padang Cermin

14個(gè)OUT種類的古菌16SrRNA基因及與其相似性最高的已發(fā)表的古菌16SrRNA基因序列用Bioedit軟件進(jìn)行序列比對后，采用軟件Mega4.1的鄰接法（neighbor－joining method）進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），由圖1可以看出，所檢測到的Padang Cermin熱泉古菌群落均屬于泉古菌門，分別屬于熱變形菌目（Thermoproteales）、硫還原球菌目（Desulfurococcales）、雜色泉古菌（miscellaneous crenarchaeotic group，MCG）和未培養(yǎng)泉古菌（uncultured Crenarchaeota，UC），其中屬于UC的OUT種類數(shù)量最多（50%），其次是屬于硫還原球菌目的OUT種類數(shù)量較多（28.57%）。

3 討 論

熱泉含有種類繁多的嗜熱微生物，包括化能無機(jī)自養(yǎng)菌、光能無機(jī)自養(yǎng)菌和化能異養(yǎng)菌等。傳統(tǒng)的依賴于培養(yǎng)的技術(shù)僅能發(fā)現(xiàn)自然界中0.1%～10%的微生物［21］。免培養(yǎng)技術(shù)（uncultured－independent techniques），即分子生物學(xué)技術(shù)，包含了從環(huán)境基因組DNA的提取、16SrRNA基因的擴(kuò)增等突破了以往依賴于培養(yǎng)的技術(shù)的不足，越來越多地應(yīng)用于生態(tài)學(xué)研究［14］。

對構(gòu)建的印度尼西亞蘇門答臘Padang Cermin熱泉古菌16SrRNA基因文庫的分析表明，該文庫克隆均為未培養(yǎng)的泉古菌，與其他熱泉的古菌群落的相似性較低。這表明，由于其生境的獨(dú)特性，Padang Cermin熱泉可能具有特殊的古菌群落；此外，目前對熱泉中泉古菌的多樣性及其在生物地球化學(xué)中作用的認(rèn)識(shí)還很匱乏。

泉古菌門作為古菌的一大分支，包含很多超嗜熱生物，但在某些海洋里的超微浮游生物中也占有相當(dāng)比例（尚未成功培養(yǎng)），也有從腸道中分離出的種類（餐古菌目），與其它古菌的主要區(qū)別在于16SrRNA的序列。從系統(tǒng)發(fā)育樹上看，泉古菌的分支相對較短，且非常接近古菌的基部。按照伯杰氏手冊，泉古菌門只分1個(gè)綱和4個(gè)目：熱變形菌綱（Thermoprotei）、暖球形菌目（Caldisphaerales）、硫還原球菌目（Desulfurococcales）、硫化葉菌目（Sulfolobales）和熱變形菌目（Thermoproteales）。

在本研究構(gòu)建的Padang Cermin熱泉古菌16SrRNA基因文庫中，發(fā)現(xiàn)了硫還原球菌目和熱變形菌目。Kormas等［22］的研究表明熱變形菌目可能在熱液生境中發(fā)揮重要作用。迄今為止，熱變形菌目的純培養(yǎng)物僅僅從高溫陸地或淡水環(huán)境中分離到［15］。而對硫還原球菌目來說，盡管決定其發(fā)生的環(huán)境因子還不清楚，但好像相對較高的溫度（＞85℃）比較適應(yīng)其生長［15］。

本研究表明，Padang Cermin熱泉古菌群落與已報(bào)道的其他熱泉古菌群落的相似性較低。宋兆齊等［4］的研究也表明，中國騰沖熱泉與世界其它同類熱泉之間的泉古菌類群存在著一定的差異，如兩溫泉的克隆序列與已知GenBank上關(guān)系最近序列的平均相似性較低，無名泉為92.56%，熱爆區(qū)為93%。而孫盼等［23］通過構(gòu)建16SrRNA基因文庫，對富含高分子有機(jī)物的云南洱源牛街熱泉原核微生物多樣性的分析表明，該熱泉包含廣古菌和泉古菌兩個(gè)類群，其中以廣古菌為優(yōu)勢類群。

生境條件決定著古菌群落的多樣性及其生理與新陳代謝特征［11］。Costa等［24］報(bào)道美國大盆地?zé)崛狦BS和G04b中氨氧化菌為優(yōu)勢菌群，這與該熱泉中高濃度的NO3－和NO2－相一致，表明硝化作用可能為厭氧菌提供了重要的電子受體。熱泉古菌的多樣性也與其形成時(shí)間有關(guān)，比如，在形成時(shí)間較久的熱泉GBS和G04b中，其古菌群落比較類似，均都由泉古菌組成；而在形成時(shí)間較短的熱泉SSW和SSE中，盡管古菌群落多樣性較強(qiáng)，但也是以泉古菌為主［24］。對新西蘭Waiotapu熱泉Champagne Pool的古菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性分析表明，通過培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術(shù)檢測到了硫氧化菌（Sulfolobus）、硫還原菌（Thermoanaerobacter和Thermofilum）和依賴于硫的熱球菌（Thermococcus），這與該熱泉的理化特征相符合。作者認(rèn)為，Champagne Pool熱泉中豐富的硫化物為硫氧化菌、硫還原菌和熱球菌的生長提供了條件［25］。

研究表明，所有與Padang Cermin熱泉古菌的14個(gè)OTUs親緣關(guān)系最近的均是未培養(yǎng)的古菌克隆，這和冰島地下熱泉微生物的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果相一致。該研究基于16SrRNA基因的分析表明，所有序列均與嗜熱微生物相關(guān)，幾乎所有OTUs都是新的、未得到純培養(yǎng)［12］。這些研究結(jié)果均表明，該熱泉具有獨(dú)特的微生物生物圈，其中遍布著嗜熱微生物。

有觀點(diǎn)認(rèn)為泉古菌門的所有獨(dú)立種群均是極端嗜熱的，而非嗜熱泉古菌到目前為止仍未分離出來。嗜熱泉古菌主要是在深海熱煙囪和陸地?zé)崛邪l(fā)現(xiàn)的，特征是高溫（＞80℃）和低pH值（＜6），可以化能自養(yǎng)方式利用還原性無機(jī)化合物，如H2和還原性硫等。泉古菌的該特性連同生命樹群的深入分支說明生命最后共同的祖先可能是在熱液體系中的嗜熱自養(yǎng)生物。非嗜熱泉古菌和嗜熱泉古菌有很近似的系統(tǒng)關(guān)系，盡管非嗜熱泉古菌在一般情況下是不可以培養(yǎng)的，但是其對敞開體系海相、陸相土壤、湖泊和地下的中低溫環(huán)境的適應(yīng)性日益增強(qiáng)［26］。

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