單大鵬，李 旭，產(chǎn)竹華，劉 洋，邵宗澤

（1.國家海洋局 第三海洋研究所，福建 廈門，361005；2.國家海洋局海洋生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門，361005；3.福建省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門，361005）

石油是土壤及海洋中的重要污染物之一，海洋溢油將經(jīng)歷溶解、揮發(fā)、光化學(xué)氧化分解、吸附、沉降、以及生物降解等一系列過程，其中生物降解是徹底消除油污的最重要途徑，利用微生物降解作用來主動(dòng)清除溢油的生物修復(fù)技術(shù)是當(dāng)今非常重要的環(huán)境生物技術(shù)［1］。生物表面活性劑具有滲透、潤濕、脫附、乳化、增溶、穩(wěn)泡和消泡等作用［2］，有助于溶解難溶的石油烴化合物，提高石油烴污染物的降解率，因而在石油污染的治理中具有很好的應(yīng)用前景［3］。在復(fù)雜環(huán)境條件（高鹽、酸堿、高溫等）下，仍能保持乳化作用的生物表面活性劑將具有更廣泛的適用性。

生物表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)包括非極性的疏水部分和極性的親水部分，具有兩親性質(zhì)［4－5］，其疏水部分為飽和、不飽和或羥化的烴鏈；其親水部分有多種形式，如糖類、氨基酸類、環(huán)狀肽類、磷酸鹽、醇等，它們一般都具有良好的降低表面張力和界面張力的性能［6］。生物表面活性劑最主要的是脂肽、糖脂、磷脂等，其中脂肽一般為胞外產(chǎn)物，離去菌體后存在于上清或者疏水層中［7－8］?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的脂肽主要來自Bacillus屬，如B.subitilis，B.circulans，B.cereus，B.polymyxa，B.mesentericus等。除了Bacillus產(chǎn)生脂肽外，其他一些種類的微生物也產(chǎn)脂肽。例如Mycobacteriumfortuirum，Streptomycescanus，Pseudomonasfluorescens，Serratiamarcescens等［9］。

生物表面活性劑一般產(chǎn)量很低，純化成本高，因而限制了實(shí)際應(yīng)用［10］。優(yōu)化發(fā)酵工藝是提高生物表面活性劑產(chǎn)量的主要途徑之一。Plackett－Burman法可以從多個(gè)因素中快速確定其中最為關(guān)鍵的發(fā)酵參數(shù)，Willians曾將該方法與隨機(jī)平衡實(shí)驗(yàn)、部分因子實(shí)驗(yàn)相比較，認(rèn)為Plackett－Burman法在篩選試驗(yàn)重要因子方面最為有效和準(zhǔn)確［11］。響應(yīng)面分析法中的Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)是一種三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)法，適用于2～5個(gè)因素的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)［12］。由于該方法的試驗(yàn)次數(shù)均在因素?cái)?shù)的4倍以上，一般都能獲得良好的擬合結(jié)果［13］。

渤海岸邊污染土壤中篩選獲得表面活性劑產(chǎn)生菌BO2，對(duì)其進(jìn)行了菌株的鑒定及生理生化分析，并利用Plackett－Burman和Box－Behnken試驗(yàn)，確定產(chǎn)生表面活性劑的最佳培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組成，為工業(yè)化生產(chǎn)的工藝優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌 株

菌株BO2，于2010－07分離自渤海東營港5號(hào)碼頭油污染土壤，并以玻璃管形式、－80℃低溫保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

分離、純化培養(yǎng)基采用2216E培養(yǎng)基：酵母粉1g·L－1，胰蛋白胨5g·L－1，磷酸鐵0.01g·L－1，瓊脂16g·L－1（液體培養(yǎng)基不加瓊脂），天然海水1 000mL，pH 7.6，121℃濕熱滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉2g·L－1，胰蛋白胨10g·L－1，NH4NO31g·L－1，液體石蠟40mL·L－1，大豆油40mL·L－1，MgSO40.5g·L－1，KH2PO41g·L－1，F(xiàn)eSO40.28mg·L－1，SrCl20.01g·L－1，天然海水1 000mL，pH 7.6。121℃濕熱滅菌20min。FeSO4·7H2O溶液經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后，加入到滅菌后的培養(yǎng)基中。

蛋白胨、酵母粉、液體石蠟、大豆油（市售）；柴油（市售零號(hào)柴油）；NaCl，KH2PO4，F(xiàn)eSO4·7H2O，MgSO4，NH4NO3，F(xiàn)ePO4，SrCl2，HCl，NaOH均為分析純。甲醇、氯仿、丙酮、二氯甲烷、乙酸、茚三酮均為分析純。

1.3 菌株的鑒定及生理生化分析

1）革蘭氏染色：菌株接種于2216E固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)24h后，進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢［14］。

2）電鏡觀察：取培養(yǎng)24h的新鮮菌體用無菌生理鹽水重懸菌體，6 000r／min離心5min棄上清，再用無菌超純水重懸菌體，6 000r／min離心5min棄上清，將離心后的菌體用磷鎢酸溶液制成懸液點(diǎn)在200目的銅網(wǎng)上，吸附3～5min后用干凈的濾紙吸去多余菌液，在白熾燈下干燥1h后上透射電鏡（日本電子公司JEM－1230）觀察，加速電壓設(shè)定為120kV并拍照。

3）生理生化鑒定：參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》測(cè)定菌株對(duì)糖醇利用、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、生長溫度、pH范圍、耐鹽試驗(yàn)、溶菌酶抗性、V－P測(cè)定、接觸酶反應(yīng)、吲哚反應(yīng)、明膠穿刺、淀粉水解、硝酸鹽還原、厭氧生長、檸檬酸鹽利用、苯丙氨酸脫氨酶活性、酪素水解和酪氨酸水解［14］。

4）16SrDNA序列測(cè)定與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的分析：采用細(xì)菌總DNA提取試劑盒（北京賽百盛基因技術(shù)有限公司），按照說明書提取菌株BO2基因組總DNA。采用細(xì)菌16SrDNA的通用引物16Sf 5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′16Sr 5′－ACGGCTACCTTGTTACGACT－3′PCR 擴(kuò)增16SrDNA。DNA 測(cè)序由上海美吉生物公司完成。將菌株BO2的16SrDNA序列（約1.5Kb）同GenBank數(shù)據(jù)庫中選取的與其親緣關(guān)系較近的菌株用BioEdit軟件的多序列比對(duì)排列（Clustalw multiple alignment）進(jìn)行序列比對(duì)，用DNA Star軟件進(jìn)行序列相似性比較，系統(tǒng)發(fā)育分析采用Mega4.0軟件的鄰接法（Neighbor－joining method）進(jìn)行［4］。

1.4 培養(yǎng)方法擴(kuò)大培養(yǎng)

從2216E固體培養(yǎng)基平板上挑取一環(huán)BO2菌株，接種于50mL 2216E液體培養(yǎng)基內(nèi)，30℃，200r／min（后續(xù)試驗(yàn)均采用此搖床轉(zhuǎn)速）活化培養(yǎng)2d。取0.1mL菌液再次接種到50mL 2216E液體培養(yǎng)基內(nèi)，同條件活化培養(yǎng)，作為后續(xù)試驗(yàn)菌種。

發(fā)酵培養(yǎng)：以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量將活化后的菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 表面活性劑定性分析

脂肽定性分析參考文獻(xiàn)［15］。細(xì)菌脂肽表面活性劑多為環(huán)脂肽，經(jīng)濃鹽酸水解后，N－端裸露，茚三酮染色呈陽性。脂肽的薄層層析法與脂肽檢測(cè)：菌株BO2于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)36h后取3L發(fā)酵液，4℃、11 000r／min離心25min，取疏水層用3倍體積的正己烷除去未降解的烷烴，用氯仿∶甲醇＝1∶1等體積抽提3～4次，合并抽提液，40℃旋蒸濃縮（添加無水硫酸鈉除水）至2mL。用移液器點(diǎn)樣至已活化好的硅膠板上（德國Merck公司GF254TLC薄層層析硅膠板）。將硅膠板放入已飽和的層析缸中展開，取出硅膠板之后，待展層溶劑揮發(fā)干后于顯色劑下顯色［16－17］。TLC展開劑的體積比為氯仿∶甲醇∶水＝65∶15∶2，顯色劑為質(zhì)量濃度2g·L－1的茚三酮水溶液。

1.6 生物表面活性劑定量分析

將菌株BO2菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)。0～48h內(nèi)每隔4h取樣測(cè)定發(fā)酵液菌體生物量（OD600nm）以及發(fā)酵上清液的表面張力，繪制生長曲線及表面張力隨時(shí)間變化的曲線［18］。分析BO2生長曲線與表面張力的變化趨勢(shì)及相互關(guān)系，確定最適發(fā)酵時(shí)間。

將菌株BO2菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在21，24，27，30，33，36℃進(jìn)行培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定菌體生物量（OD600nm）以及發(fā)酵上清液的表面張力，確定最適發(fā)酵溫度。

表面張力的測(cè)定：采用環(huán)法JYW－200A自動(dòng)界面張力儀測(cè)定表面張力［19］。

乳化性能的測(cè)定：取5mL柴油和5mL發(fā)酵上清混勻，超聲處理40s，在0～24h內(nèi)測(cè)量乳化層和油相高度。乳化穩(wěn)定值（EI24）＝ 乳化層高度（cm）／油相高度（cm）×100%［19－20］。

1.7 表面活性劑穩(wěn)定性試驗(yàn)

溫度處理：菌株BO2于發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)36h后取5份發(fā)酵上清液，分別20，40，60，80，100℃水浴處理1h，測(cè)定表面張力和乳化系數(shù)。酸堿處理：菌株BO2于發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)36h后取5份發(fā)酵上清液，用6mol·L－1的HCl溶液和1mol·L－1的NaOH溶液將其pH分別調(diào)為2，4，6，8，10，靜置10min，測(cè)定表面張力和乳化系數(shù)。鹽度處理：菌株BO2于發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)36h后取5份發(fā)酵上清液，分別加入NaCl，使其NaCl質(zhì)量濃度為30，60，90，120，150g·L－1，靜置10min，測(cè)定表面張力和乳化系數(shù)。

1.8 培養(yǎng)基的優(yōu)化

以發(fā)酵上清液乳化系數(shù)為響應(yīng)目標(biāo)，采用Design Expert Version 7.0軟件，進(jìn)行2步法進(jìn)行優(yōu)化。

1）Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)：Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)目的在于確定顯著因素。選取菌株BO2產(chǎn)表面活性劑培養(yǎng)基中的7個(gè)因素（胰蛋白胨、NH4NO3、液體石蠟、大豆油、FeSO4、MgSO4、KH2PO4）另加一個(gè)誘導(dǎo)因素（SrCl2）共8個(gè)因素作為變量，另設(shè)3個(gè)虛擬變量。每種待篩選因素設(shè)置一高一低兩個(gè)水平，分別用“＋”，“－”號(hào)表示，利用Design Expert軟件生成Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)表格進(jìn)行試驗(yàn)，各因素的表現(xiàn)水平見表1。在Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)中，各變量對(duì)于乳化系數(shù)影響大小的一元擬合等式：

式中，Y是預(yù)測(cè)的響應(yīng)值，β0和βi是常量系數(shù)，χi是編碼的獨(dú)立因素。以發(fā)酵上清液乳化系數(shù)為響應(yīng)值，選取可信度大于95%的因素作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的變量，即對(duì)表面活性劑效果促進(jìn)明顯的主要因素。

2）Box－Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)：Box－Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)用于優(yōu)化培養(yǎng)基配方。根據(jù)Plackett－Bur－man實(shí)驗(yàn)的篩選結(jié)果，取可信度為95%以上的顯著因素為變量；其他因素視為非顯著性因素，一律取其高低值的低值。利用Design Expert Version 7.0軟件生成Box－Behnken實(shí)驗(yàn)表格進(jìn)行試驗(yàn)。仍以乳化系數(shù)為響應(yīng)值，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)學(xué)建模分析，得出能使乳化系數(shù)達(dá)到最大值的培養(yǎng)基配方。并根據(jù)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)Box－Behnken分析實(shí)驗(yàn)的可靠性。

表1 Plackett－Burman設(shè)計(jì)中各因素變化水平Table 1 Levels of the variables of Plackett－Burman design

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2003軟件進(jìn)行單因素方差分析和顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 BO2菌株的透射電鏡形態(tài)Fig.1 The transmission electron microscope photoraph of BO2

2.1 菌株形態(tài)及生理生化特性

1）形態(tài)：BO2菌株在2216E平板生長，菌落直徑2～3mm，白色不透明，表面粗糙，中央隆起，外型規(guī)則，邊緣平整，無暈圈。透射電鏡下菌體形態(tài)為細(xì)胞呈短桿狀，大小約為1.1μm×0.5 μm，無鞭毛，菌體邊緣平滑（圖1）。

2）生理生化鑒定：BO2菌株呈革蘭氏陽性，能形成芽孢，厭氧條件不生長，甲基紅試驗(yàn)陽性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，葡萄糖培養(yǎng)產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，可液化明膠，水解淀粉，水解酪素。

3）rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹：16SrDNA分子鑒定結(jié)果表明菌株BO2為芽孢桿菌屬（Bacillus），由系統(tǒng)發(fā)育樹可知BO2與Bacillus methylotrophicus的親緣關(guān)系最近（圖2），同源性98.63%。

2.2 表面活性劑的薄層層析鑒定結(jié)果

利用發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)BO2菌株36h。發(fā)酵液4℃、11 000r／min離心25min除去菌體，取疏水層提取表面活性物質(zhì)。該物質(zhì)經(jīng)TLC展層分離，直接用茚三酮進(jìn)行染色，結(jié)果呈陰性；將薄層板放入裝有濃鹽酸的密封瓶內(nèi)原位水解后，再用茚三酮染色，顯紅色斑點(diǎn)（圖3）。因此判斷，BO2表面活性劑是一種環(huán)狀脂肽類化合物。

圖2 基于菌株BO2和相關(guān)菌株16SrDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（鄰接法）Fig.2 Phylogenetic tree constructed by the neighbor joining approach based on the 16SrDNAs of BO2and related strains

圖3 菌株BO2產(chǎn)表面活性劑薄層色譜（TLC）Fig.3 Thin－layer chromatography of the biosurfactant produced by strain BO2

2.3 生物表面活性劑產(chǎn)生與菌體生長之間的關(guān)聯(lián)

利用發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)BO2菌株，結(jié)果顯示在對(duì)數(shù)生長期，發(fā)酵上清液的表面張力隨菌體生長而下降；20h時(shí)菌體生長進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵上清液表面張力繼續(xù)下降；36h時(shí)表面張力降到最低值31.0mN／m，故取36h作為最適發(fā)酵時(shí)間（圖4）。

利用發(fā)酵培養(yǎng)基，以36h作為BO2菌株培養(yǎng)時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)果顯示30℃培養(yǎng)時(shí)發(fā)酵上清液表面張力值最低。故取30℃作為最適培養(yǎng)溫度（圖5）。

2.4 表面活性劑的理化穩(wěn)定性

溫度影響實(shí)驗(yàn)表明，溫度升高會(huì)使BO2菌株發(fā)酵上清液表面張力小幅度上升，處理溫度超過60℃后其乳化系數(shù)明顯下降，最適作用溫度在40℃左右（圖6）。

pH影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，較高或較低的pH環(huán)境均會(huì)使BO2菌株發(fā)酵上清液表面張力小幅度升高，其最低點(diǎn)介于pH 6～8；環(huán)境pH在6以下時(shí)乳化系數(shù)急劇降低，這與脂肽的酸沉降性質(zhì)相吻合，最適作用pH為8左右（圖7）。

NaCl質(zhì)量濃度（g·L－1）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BO2菌株發(fā)酵上清液表面張力隨NaCl質(zhì)量濃度升高有小幅度波動(dòng)，其最低點(diǎn)ρNaCl為30g·L－1；乳化系數(shù)隨NaCl質(zhì)量濃度升高也有所波動(dòng)，其最高點(diǎn)ρNaCl也為30g·L－1；整體上，菌株BO2所產(chǎn)脂肽類表面活性劑對(duì)不同NaCl質(zhì)量濃度的適應(yīng)性較好（圖8）。

2.5 表面活性劑培養(yǎng)基的優(yōu)化

1）Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)：Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，D1，D2，D3為3個(gè)虛擬變量。根據(jù)表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用軟件進(jìn)行一次回歸分析，回歸方程：Y（%）＝40.19＋4.01×X1＋10.31×X2＋7.46×X3＋3.62×X4－2.83×X5－5.34×X6－12.13×X7－1.79×X8。各因素的主效應(yīng)分析結(jié)果見表3，X2（NH4NO3）、X3（液體石蠟）、X7（KH2PO4）可信度均大于95%，為主要影響因素。模型的顯著性為96.29%（＞95%），說明模型對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很好的解釋。

2）Box－Behnken優(yōu)化試驗(yàn)

以A（液體石蠟）、B（NH4NO3）、C（KH2PO4）作為自變量，其他非主要因素維持低水平。仍以乳化系數(shù)為響應(yīng)值，采用三因素三水平的Box－Behnken響應(yīng)面分析法進(jìn)一步對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表4，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

根據(jù)表5中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用軟件的響應(yīng)面回歸對(duì)其進(jìn)行二次回歸分析，回歸方程：Y（%）＝63.80＋6.5×A－2.12×B＋1.63×C－1.75×A×B－1.75×A×C＋3.0×B×C－10.15×A2－11.40×B2－8.90×C2。

通過變異系數(shù)分析對(duì)二次方程的顯著性進(jìn)行分析，結(jié)果見表6。

F值為4.77（＞4）說明該模型顯著，只有2.58%的機(jī)率模型不能擬合。P值為0.025 8（＜0.05）也說明模型顯著，A，A2，B2，C2是顯著的影響因子。模型擬合R2為0.859 8，說明該模型對(duì)實(shí)驗(yàn)中85.98%的情況可以解釋，即模型預(yù)測(cè)與實(shí)驗(yàn)擬合具有較好的一致性。

各因素的響應(yīng)面及等高線（圖9～11）顯示，預(yù)測(cè)的乳化系數(shù)最大值在曲面頂點(diǎn)處。通過分析預(yù)測(cè)模型得出：A，B，C的最佳值分別為0.327，－0.11，0.04，與之對(duì)應(yīng)的液體石蠟體積濃度為49.80mL·L－1，NH4NO3，KH2PO4的質(zhì)量濃度分別為1.39，1.54g·L－1，其他成分為酵母粉0.7g·L－1、胰蛋白胨3g·L－1、大豆油20mL·L－1、FeSO40.14mg·L－1、MgSO40.25g·L－1、SrCl20.05g·L－1、天然海水1 000 mL，對(duì)應(yīng)預(yù)測(cè)的乳化系數(shù)最大值為65%。以此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)得到菌株BO2發(fā)酵上清液乳化系數(shù)為67.3%，在原基礎(chǔ)上提高了14.3%，說明預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致性較高，并證明了預(yù)測(cè)模型的可靠性。

表2 Plackett－Burman設(shè)計(jì)篩選對(duì)發(fā)酵液乳化系數(shù)有顯著影響的因素Table 2 Plackett－Burman design for screening of significant factors affecting EI24of the culture

表3 8個(gè)待選因素對(duì)于表面活性劑乳化系數(shù)的顯著性分析Table 3 The significance analysis of 8selected factors according to biosurfactant EI24

表4 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 4 Levels and factors tested in the Box－Behnken design

表5 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Experiment design and results of the Box－Behnken design

表6 乳化系數(shù)二次響應(yīng)模型的方差分析Table 6 ANOVA for response surface quadratic model for EI24

3 討 論

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，菌株BO2與Bacillusmethylotrophicus有最近的親緣關(guān)系，目前未見報(bào)道B.methylotrophicus產(chǎn)生生物表面活性劑。大多生物表面活性劑由于產(chǎn)量較低、制備成本高導(dǎo)致應(yīng)用受限，故直接應(yīng)用發(fā)酵液為一種較可行的選擇。張明露等以一株芽孢桿菌的發(fā)酵液對(duì)石油烴進(jìn)行乳化實(shí)驗(yàn)，證明了此方法的可行性［21］。芽孢桿菌BO2菌株無需誘導(dǎo)就能利用簡單廉價(jià)的氮磷營養(yǎng)和石蠟，產(chǎn)生環(huán)狀脂肽類表面活性劑乳化石油，發(fā)酵2d后可使培養(yǎng)基表面張力由53.0mN·m－1降至31.0mN·m－1。研究中還發(fā)現(xiàn)，BO2菌株的表面活性劑適用于多種極端環(huán)境，包括高鹽（ρNaCl為150g·L－1）、堿性（pH10）、較高溫度（60℃），其乳化能力和降低溶液表面張力均有良好的表現(xiàn)，因此其適用范圍廣、耐受能力強(qiáng)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

國內(nèi)外一些研究應(yīng)用RSM法優(yōu)化產(chǎn)表面活性劑菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基，劉佳等以菌體生長量為響應(yīng)系數(shù)對(duì)一株產(chǎn)堿桿菌的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，證明石蠟、牛肉膏、K2HPO4／KH2PO4為顯著因素［22］。Sivapathasekaran等以表面活性劑粗提物為響應(yīng)系數(shù)，對(duì)一株環(huán)狀芽孢桿菌的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，證明葡萄糖，尿素、SrCl2、MgSO4為顯著因素［23］。Chen等以表面活性劑粗提物產(chǎn)量為響應(yīng)系數(shù)，對(duì)一株銅綠假單胞菌的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，MgSO4和FeSO4為顯著因素［24］。Mutalik等以表面活性劑粗提物產(chǎn)量為響應(yīng)系數(shù)，利用RSM方法中的中心復(fù)合設(shè)計(jì)（CCRD）對(duì)一株銅綠假單胞菌的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，證明甘露糖醇、酵母粉、蛋白胨和十六烷為顯著因素［25］。以上試驗(yàn)說明RSM法是一種可行的培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)方法，也說明了影響不同菌株產(chǎn)表面活性劑的因素差異很大。然而菌體生長量以及表面活性劑粗提物作為乳化系數(shù)在反映表面活性劑實(shí)際效價(jià)上都有所偏差，未能真正體現(xiàn)實(shí)際應(yīng)用中表面活性劑的作用效果。本研究采用RSM法的Box－Behnken設(shè)計(jì)，以發(fā)酵液乳化系數(shù)作為響應(yīng)值來優(yōu)化Bacillus菌屬產(chǎn)生物表面活性劑培養(yǎng)條件，可以直接準(zhǔn)確反映發(fā)酵液（生物表面活性劑）的效價(jià)，確保了優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的可靠性，結(jié)果表明，所選因素KH2PO4，NH4NO3對(duì)乳化能力的影響最大，其次是液體石蠟。因此，針對(duì)目前生物表面活性劑產(chǎn)量低，不易分離純化的問題，實(shí)際應(yīng)用中，菌株BO2可利用簡單廉價(jià)的氮磷營養(yǎng)和石蠟發(fā)酵，并直接采用發(fā)酵上清液作為表面活性劑乳化石油，既可簡化操作，又能降低成本。

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