于梅艷

(中州大學化工食品學院，鄭州450044)

膠紅酵母固定化方法研究

于梅艷

(中州大學化工食品學院，鄭州450044)

研究膠紅酵母固定化方法，并測定所得固定化細胞的機械強度和通透性，對固定化方法進行初步篩選;研究磷酸緩沖溶液對固定化細胞強度的影響，最終得到目的固定化方法。試驗表明:CA－活性炭(C)復合凝膠包埋所得固定化細胞，經(jīng)0.6%聚乙烯亞胺(PEI)強化12 h，再經(jīng)1%的戊二醛強化3 h后，機械強度大大提高，能耐磷酸緩沖液。

膠紅酵母;細胞固定化;機械強度;通透性

本文主要采用海藻酸鈣、海藻酸鋁、明膠、卡拉膠、聚乙烯醇、活性炭等載體固定化膠紅酵母，選擇合適的細胞固定化方法，以得到機械強度高、細胞通透性好且酶活保留率高的固定化細胞，最終用于生物轉(zhuǎn)化技術。

1.材料和方法

1.1 酵母菌株

膠紅酵母由鄭州大學新藥研發(fā)中心篩選。

1.2 材料

1.2.1 培養(yǎng)基

蛋白胨為0.2%，玉米漿為2%，甘油為3%。

1.2.2 原料及試劑

玉米漿由安陽第一制藥廠提供。瓊脂粉、蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、戊二醛、海藻酸鈉及其他試劑均為分析純。顆粒狀活性炭、聚乙烯亞胺為工業(yè)級。明膠、卡拉膠為食品級。磷酸緩沖溶液自制，轉(zhuǎn)化底物自制。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)細胞

接種量為1環(huán)/20 mL，放入搖床，生長溫度為32℃，搖床轉(zhuǎn)速為210 r/min，培養(yǎng)40 h。

1.3.2 固定化方法

細胞固定化按文獻［1－4］方法進行。

a.海藻酸鈉包埋法

用生理鹽水配制一定濃度的海藻酸鈉(CA)溶液20 mL，煮沸使其充分溶解，冷卻至48℃?zhèn)溆?取適量濕菌體加入生理鹽水調(diào)制成均勻的菌懸液;將菌懸液與海藻酸鈉溶液混合，并充分搖勻;將20 mL 0.05 mol/L氯化鈣溶液移入一個無菌三角瓶中;將海藻酸鈉菌體混懸液移入無菌注射器中，適度加力，將其滴入0.05 mol/L的氯化鈣溶液中;滴完后傾去溶液，加入適量無菌去離子水沖洗1次;重新加入適量0.05 mol/L氯化鈣溶液4℃平衡過夜。

b.海藻酸鋁包埋法

只需把方法a中氯化鈣換為氯化鋁即可。

c.明膠－戊二醛復合法

將明膠配制成濃度為6%的生理鹽水溶液，煮沸溶解，冷卻至48℃左右，與生理鹽水調(diào)制的菌體懸浮液在不高于45℃的條件下混合均勻，加入1%戊二醛交聯(lián)凝固，置于4℃以下的冰箱中4 h左右，取出切塊后浸泡于0.5%戊二醛中于4℃下硬化一段時間，將固定化細胞濾出、水洗后備用。

d.卡拉膠包埋法

在4.5 g卡拉膠中加入150 mL生理鹽水，沸水浴溶解后于50℃水浴;取25 g酵母菌體，加入75 mL生理鹽水，攪拌均勻后升溫至40℃，加入3 mL甲苯，立即與卡拉膠溶液混合，倒入淺盤中冷卻，加2.25%KCl，硬化 3 h，傾去 KCl，洗滌，切成 5 mm 小塊冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

e.卡拉膠－明膠復合包埋法

卡拉膠的濃度設定為3%，明膠的濃度作以下幾個平衡:3%、4%、5%、6%，將以上兩種包埋劑充分溶解并混勻，其他方法同d，得到5 mm見方小塊于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

f.聚乙烯醇(PVA)－海藻酸鈉－活性炭(C)復合凝膠包埋法

PVA 10 g，適量(2% －4%)海藻酸鈉，蒸餾水100 mL，適量(0－2%)活性炭，加熱煮沸，PVA冷卻到室溫;硼砂3 g，氯化鈣4 g，各加水50 mL，分開溶化后，混合，充分攪拌成膠狀;將收集的一定量的菌體加入到PVA中攪拌均勻。將混有菌體的PVA用注射器勻速滴入硼砂和氯化鈣混合液中，充分反應后，濾出，洗凈，即得4 mm左右均勻小珠。

1.3.3 機械強度測定方法

a.砝碼加壓法［5］

取幾個大小均勻的顆粒，上面加蓋一個載玻片，在其上加壓砝碼至壓扁不碎，平均每個顆粒的砝碼克數(shù)記為顆粒的機械強度。

b.振蕩法

取一定量的固定化細胞，在磷酸緩沖溶液中，于150 r/min上搖床震蕩，定時觀察其顆粒的變化。

1.3.4 固定化細胞耐磷酸緩沖溶液性的測定

在磷酸緩沖溶液中加入一定量的包埋顆粒靜置過夜，觀察顆粒的變化情況;上搖床培養(yǎng)再觀察顆粒的變化情況。

1.3.5 固定化細胞通透性測定方法

利用固定化細胞的生物轉(zhuǎn)化的速率來判定。轉(zhuǎn)化率為50%左右所需時間來表示，時間越少表示細胞通透性越好。

2.結(jié)果與討論

2.1 海藻酸鈉與氯化鈣濃度的影響

鈣離子是決定固定化細胞機械強度的重要因素，隨著鈣離子濃度的增加，固定化酵母的強度增加，較低的海藻酸鈉濃度使凝膠相對滲透性能好，有利于底物進入和產(chǎn)物排出。本試驗用海藻酸鈉固定化紅酵母細胞，海藻酸鈉的濃度分別為2%、4%、6%，氯化鈣溶液的濃度分別為2%、3%、4%。

從表1的結(jié)果可以看出選擇較低的海藻酸鈉濃度(4%左右)和較高的氯化鈣濃度(4%左右)形成的凝膠固定化效果較好，機械強度高，轉(zhuǎn)化底物時轉(zhuǎn)化率到達50%所需時間較短。

表1 藻酸鈉與氯化鈣濃度對固定化細胞的影響

2.2 固定化材料的選擇

2.2.1 各種方法固定化細胞的強度測定

a.耐壓性能測試

各取若干粒不同方法固定化的細胞，平放于玻璃板上，用紙覆蓋，逐漸增加砝碼的重量，并觀察細胞顆粒受壓后的完整情況，以不引起顆粒破碎而使用的最大砝碼重量來衡量細胞顆粒的機械強度，表2可以看出10%PVA－4%CA的耐壓性能最好，為120 g/粒。

表2 不同固定化細胞的耐壓性能

b.耐振蕩性能測試

各取若干粒不同方法固定化的細胞，置于pH6.0的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖溶液中，而后上搖床振蕩，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，觀察它的耐振蕩性能。從表3可以看出用卡拉膠、明膠和卡拉膠－明膠固定化的細胞均在0.5 h左右完全破碎，呈糊狀，但用CA、PVA－CA和PVA－CA－C固定化的細胞1 h左右顆粒才出現(xiàn)破裂且沒有完全破碎，這說明PVA－CA，PVA－CA－C復合凝膠固定化的細胞耐振蕩性能稍好，但也不能耐磷酸緩沖液，在磷酸緩沖液中浸泡一會幾乎就不呈顆粒。

表3 不同固定化細胞的耐振蕩性能

2.3 活性炭用量的影響

活性碳的用量對固定化細胞的通透性有一定影響，用CA－C－PVA包埋固定化細胞，活性炭的濃度為0、0.5%、1%、2%，測定轉(zhuǎn)化率為50%時的轉(zhuǎn)化時間，及其顆粒的耐壓性能，結(jié)果見表4。50%所需時間。

表4 活性炭對包埋顆粒通透性和機械強度的影響

由表4可知加活性炭的反應速率明顯高于不加活性炭的包埋顆粒，但隨著活性炭的增加顆粒的機械強度逐步減小，故活性炭的用量也不能太多，選擇0.5%。

2.4 .固定化細胞對磷酸緩沖溶液耐受性研究

據(jù)文獻［4］報道，用聚乙烯亞胺溶液來處理海藻酸鈣凝膠，分別考察了聚乙烯亞胺－戊二醛交聯(lián)強化法來提高凝膠顆?？沽姿猁}的能力，發(fā)現(xiàn)經(jīng)強化的固定化細胞的抗磷酸鹽能力、機械強度均得到了提高，并且酶活力沒有變化，操作穩(wěn)定性較好。

本試驗分別用4%CA、4%CA－0.5%C和4%CA－10%PVA－0.5%C固定化紅酵母細胞，再經(jīng)0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% 聚乙烯亞胺處理12 h，再用1%的戊二醛浸泡強化3 h，而后測其機械強度和轉(zhuǎn)化效果。試驗結(jié)果見表5和圖1。

固定化細胞的機械強度直接影響著其使用壽命，機械強度越大，在進行生物轉(zhuǎn)化過程中越耐磨，其使用壽命越長。表5的結(jié)果表明，經(jīng)PEI強化的固定化細胞，其機械強度有了明顯提高，其中PEI對4%CA－0.5%C固定化細胞強度作用最明顯，經(jīng)1%PEI強化后，其機械強度竟達到260.1g/粒，是未強化時的14.2倍。

表5 不同濃度PEI強化固定化細胞的機械強度

圖1的結(jié)果表明，PEI濃度對固定化細胞通透性有影響，隨著PEI濃度的增大，固定化細胞的通透性有明顯降低，但0.6%PEI強化4% －0.5%C固定化細胞的通透性較好，轉(zhuǎn)化效果與游離細胞相當，在磷酸緩沖溶液中進行生物轉(zhuǎn)化后，其固定化細胞顆粒完好無損，經(jīng)反復試驗，顆粒仍完好，可反復使用。

圖1 PEI濃度對不同固定化細胞通透性的影響

3.結(jié)論

本文對細胞固定化方法進行研究，用海藻酸鈣(CA)、海藻酸鋁、明膠、卡拉膠、卡拉－明膠、聚乙烯醇(PVA)－CA和聚乙烯醇－活性炭－CA復合凝膠分別對酵母細胞進行固定化，并通過測定各種方法所得固定化細胞的機械強度和通透性，對固定化方法進行初步篩選;研究磷酸緩沖溶液對固定化細胞強度的影響，最終得到4%CA－0.5%C－0.6%PEI－1%戊二醛固定化細胞機械強度好，通透性好，并且耐磷酸緩沖溶液，可以反復使用，此法固定化的細胞有望實現(xiàn)生物制藥的工業(yè)化。

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(責任編輯 呂志遠)

Abstract:The immobilization methods were studied in this paper.The immobilization methods were primarily screened by evaluating the mechanical intension and permeability of immobilized cell granules.The influence on buffer of immobilized cells was studied later and the optimum immobilized method was selected.The batch experiment results indicated that the immobilized cell granules obtained by active carbon－CA complex treated and intensified by 0.6%polyethylene imine and 1%Glutaraldehyde had the best mechanical intension，permeability and endurance on phosphate buffer solution.

Key words:Rhodotorula mucilaginosa;immobilized cell;mechanical intension;permeability

Study on the Immobilization Methods of Rhodotorula Mucilaginosa

YU Mei－yan
(College of Chemical and Food Engineering，Zhongzhou University，Zhengzhou 450044，China)

TQ92

A

1008－3715(2012)03－0123－03

2012－03－01

于梅艷(1980—)，女，河南周口人，碩士，中州大學化工食品學院助教，研究方向:固定化細胞技術及其應用。