李 巍，李 寧，袁萬哲，孫繼國

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定071000）

牛輪狀病毒（Bovine rotavirus，BRV）屬于呼腸病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rotavirus）成員，該病毒由美國 Mebus C A等［1］首次分離鑒定，并證明了其對犢牛的致病性。已知牛輪狀病毒是犢牛非細菌性腹瀉的主要病原之一［2］，可引起1日齡～7日齡犢牛的精神沉郁、食欲廢絕、水樣腹瀉、嚴重脫水和酸中毒等臨床癥狀，感染犢牛常常發(fā)生死亡，病死率高達50%。據(jù)報道加拿大魁北克地區(qū)腹瀉犢牛中輪狀病毒的檢出率高達74.3%［3］，英國犢牛輪狀病毒腹瀉的發(fā)病率為60%～80%，病死率為0%～50%［4］，我國也有犢牛感染輪狀病毒的報道。該病自報道以來，已在全世界主要養(yǎng)牛國家和地區(qū)普遍發(fā)生和流行，給養(yǎng)牛業(yè)造成相當(dāng)嚴重的經(jīng)濟損失。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop－mediated isothermal amplification，LAMP）是由 Notomi T等［5］建立的一種新型核酸擴增技術(shù)，其原理是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件下進行自動循環(huán)的鏈置換核酸擴增反應(yīng)，其產(chǎn)物鑒定可直接通過白色沉淀或熒光來進行判斷［6］。該技術(shù)具有特異性高、操作簡便、反應(yīng)迅速、成本低廉等優(yōu)點，目前在一些病原微生物的檢測中開始被廣泛應(yīng)用［7－8］。本研究根據(jù)LAMP反應(yīng)原理，優(yōu)化相關(guān)反應(yīng)條件，建立了牛輪狀病毒的反轉(zhuǎn)錄－環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（RT－LAMP）快速檢測方法，為牛輪狀病毒的基層檢測和該病防控奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、病料與細胞 牛輪狀病毒（BRV）、沙門菌、豬圓環(huán)病毒2型（PCV－2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）均河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院傳染病實驗室分離保存，牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）為中國獸監(jiān)察所保存；腹瀉犢牛糞便采集于當(dāng)?shù)嘏?。Marc－145細胞由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院傳染病實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 SYBR GreenⅠ為Solarbio公司產(chǎn)品；d NTPs、Taq DNA聚合酶為天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)；MgCl2為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；Bst DNA聚合酶為NEB公司產(chǎn)品；RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、TransZol均為北京全式金生物科技公司產(chǎn)品，DMEM為Gibcobrl公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)登錄于GenBank的BRV VP7基因序列（GU984762.1），應(yīng)用 DNA Star進行序列比對后利用Primer premier 5進行普通PCR擴增引物設(shè)計，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列為：

VP7S：5′－GTATGGTATTGAATATACCAC－3′；VP7A：5′－GATCCTGTTGGCCATCC－3′。

根據(jù)登錄于GenBank的BRV VP7基因序列，應(yīng)用DNA Star進行序列比對后利用Primer ex－plorer V4進行外引物和內(nèi)引物的設(shè)計，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列為：

F3：5′－GCACCATACGCAACTGTA－3′；B3：5′－TGATTGACGTAATCCACTACC－3′；FIP（F1c＋F2）：5′－GTCTAAAACATTTGCGCCGC－AAGTTAGGACCAAGGGAGA－3′；BIP（B1c＋B2）：5′－TCACAGCTGATCCAACAACTACACGT GTAAAACACTTGCCACC－3′。其中 F3、B3為外引物，F(xiàn)IP、BIP為內(nèi)引物。

1.2 方法

1.2.1 病料的處理及接種 將犢牛腹瀉糞便樣品用p H7.4的 PBS稀釋成200 g／L 的懸液，3 000 r／min離心 20 min，取上清，加入雙抗 （10 000 U／mL），將病料與50μg／mL的胰酶按1∶1混合，37℃處理1 h，接種于生長良好的Marc145單層細胞，37℃吸附1 h，其間每15 min搖勻1次，加入維持液，在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)觀察，48 h～72 h為一個傳代周期。傳代前培養(yǎng)物凍融3次，與50μg／mL胰酶按1∶1混合，進行盲傳，待細胞出現(xiàn) 病變（CPE）達70%收毒。

1.2.2 BRV核酸的提取 按Trizol法提取病毒RNA。取病毒液250μL，加入750μL TransZol，劇烈震蕩，室溫放置5 min；加入250μL氯仿，劇烈震蕩后室溫放置10 min，4℃下12 000 r／min離心15 min；取上清550μL轉(zhuǎn)入到另一1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇顛倒混勻，室溫沉淀15 min，4℃下12 000 r／min離心20 min；棄上清液，用750 mL／L的乙醇溶液800μL洗滌沉淀，干燥10 min～20 min后用10μL溶解液溶解RNA沉淀，溶解后于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT－LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化

1.2.3.1 RT－LAMP反應(yīng)組分的優(yōu)化 根據(jù)反應(yīng)體系優(yōu)化的策略［9］，對反應(yīng)組分中 Mg2＋濃度、d NTPs濃度、Bst DNA聚合酶濃度、引物濃度進行優(yōu)化。其他成分：反轉(zhuǎn)錄酶1.0μL，RNA酶抑制劑0.5μL，模板2.0μL最后用水補至25μL。

試驗中將 MgCl2（25 mmol／L）的量以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0μL依次遞增；將d NTPs（2.5 mmol／L）的量以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 μL依次遞增；將Bst DNA聚合酶 （8 U／μL）以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μL依次遞增；在引物初濃度均為10μmol／L條件下，研究了RT－LAMP反應(yīng)的引物間比例，依次按照以下比例加入外引物與內(nèi)引物：0∶1，1∶0，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，選擇最佳濃度比。從多次重復(fù)試驗中確定各組分最佳用量。

1.2.3.2 RT－LAMP的可視性觀察 將反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μL SYBR GreenⅠ，1 min～5 min后觀察結(jié)果，陽性呈綠色，陰性保持原有顏色。

1.2.3.3 RT－LAMP反應(yīng)體系中反應(yīng)溫度的優(yōu)化因為本研究所涉及的序列AT含量較為豐富，所以根據(jù)引物Tm值的變化范圍，將溫度按58、59、60、61、62、63、64℃依次遞增，從多次重復(fù)試驗中確定最佳反應(yīng)溫度。分別取其4μL反應(yīng)產(chǎn)物上樣于20 g／L瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.3.4 RT－LAMP反應(yīng)體系中反應(yīng)時間的優(yōu)化為了檢測反應(yīng)時間對RT－LAMP試驗的影響，將反應(yīng)時間依次按照10、20、30、40、50、60 min進行擴增，分別取其4μL反應(yīng)產(chǎn)物上樣于20 g／L瓊脂糖凝膠電泳，選擇可完成RT－LAMP反應(yīng)的最佳時間。

1.2.4 RT－LAMP的特異性檢測 在優(yōu)化后的條件下，分別以沙門菌、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV－2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）為模板，以細胞營養(yǎng)液為陰性對照，同時進行RT－LAMP反應(yīng)，分別取4μL反應(yīng)產(chǎn)物用20 g／L瓊脂糖凝膠進行電泳分析，觀察結(jié)果。

1.2.5 RT－LAMP與 RT－PCR靈敏度的對比檢測測得體外轉(zhuǎn)錄的RNA濃度為6.52 mg／L，將其進行倍比稀釋，其濃度依次為6.52×10－1mg／L～6.52×10－16mg／L。用所建立的RT－LAMP檢測方法分別對其進行擴增，同時用RT－PCR方法進行擴增，取4μL反應(yīng)產(chǎn)物上樣于20 g／L瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.6 陽性樣品的檢測 將6個陽性糞樣，1個陰性糞樣樣品和1個標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品（BRV的細胞培養(yǎng)液）分別經(jīng)過處理提取核酸后作為模板，用優(yōu)化條件后的RT－LAMP進行檢測，反應(yīng)產(chǎn)物用20 g／L瓊脂糖凝膠進行電泳分析，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 RT－LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.1.1 RT－LAMP反應(yīng)組分的優(yōu)化 優(yōu)化后的反應(yīng)組分體系見表1，優(yōu)化后反應(yīng)結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳見圖1，可視化結(jié)果見圖2。

2.1.2 RT－LAMP反應(yīng)體系中溫度的優(yōu)化 通過對溫度的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)此方法進行RT－LAMP擴增反應(yīng)的最適溫度為62℃。在此溫度下，電泳條帶清晰明亮（圖3）。

2.1.3 RT－LAMP反應(yīng)體系中時間的優(yōu)化 通過對時間的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)此體系只需要20 min就能得到較淡的條帶，50 min可以得到十分清晰的反應(yīng)條帶（圖4）。

表1 RT－LAMP優(yōu)化后的反應(yīng)體系Table1 Reaction system of RT－LAMP after optimization

2.2 RT－LAMP的特異性試驗

本研究用沙門菌、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV－2）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）為對照，以細胞營養(yǎng)液為陰性對照，在相同的優(yōu)化條件下同時進行RT－LAMP擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，只有以BRV為模板才能擴增出清晰的梯形條帶，說明該方法特異性較好（圖5）。

2.3 RT－LAMP與RT－PCR的靈敏性試驗

從細胞培養(yǎng)液中提取的RNA進行連續(xù)10倍稀釋，分別用RT－PCR和RT－LAMP進行靈敏性試驗。細胞培養(yǎng)液中提出的總DNA質(zhì)量濃度為6.52 mg／L，隨著RNA濃度的降低，目的條帶亮度逐漸變淡（圖6～圖），RT－LAMP能檢測出的最低RNA濃度為6.52×10－8mg／L，RT－PCR能檢測到6.52×10－6mg／L。結(jié)果表明，RT－LAMP 比 RT－PCR的靈敏度高100倍。

2.4 陽性樣品的檢測

使用已建立的方法，對PCR檢測呈陽性的6個陽性樣品進行擴增，結(jié)果都可擴增出清晰的梯形條帶。表明建立的RT－LAMP方法可以用于對BRV病料的檢測（圖8）。

3 討論

輪狀病毒是導(dǎo)致人和各種幼畜病毒性腹瀉的重要病原體［10］。犢牛的輪狀病毒感染十分普遍，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。同時，該病又與其他細菌和病毒引起的腹瀉性疾病在臨床上難以鑒別，所以準(zhǔn)確的診斷對科學(xué)防控本病具有重要意義。目前實驗室檢測BRV的方法有血清學(xué)抗體檢測、電鏡觀察、ELISA、核酸探針、RT－PCR等。但是電鏡觀察、核酸探針的成本較高而且需要昂貴的儀器，因此不適合大規(guī)模使用；血清學(xué)抗體檢測、ELISA常常受到交叉反應(yīng)的影響而呈現(xiàn)假陽性結(jié)果；RT－PCR很有效但是耗時較長，無法做到簡便快捷；Real－time PCR從靈敏度、特異性與速度上都具有一定優(yōu)勢，但是檢測成本較高。

LAMP是日本的Notomi T等在2000年創(chuàng)建的檢測核酸新的技術(shù)。其原理是分別針對靶序列中6個基因區(qū)段設(shè)計2對特異引物，在反轉(zhuǎn)錄酶和Bst DNA聚合酶的作用下對靶序列進行等溫核酸擴增反應(yīng)，一步完成RNA的檢測。該技術(shù)因其特異性強，擴增效率高，反應(yīng)靈敏，操作簡單，結(jié)果肉眼可見而被國內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用到多種細菌及病毒的基因檢測中，如馬輪狀病毒（ERV）、丙型肝炎病毒（HCV）、禽流感病毒（AIV）等。但目前很少見到使用該技術(shù)檢測BRV的報道。本研究所建立的RT－LAMP方法檢測臨床樣本中BRV的結(jié)果表明，該方法具有靈敏度高，特異性強，檢測程序簡單快捷，不需要特殊儀器等優(yōu)點，有望成為適合臨床應(yīng)用的新方法。

本研究選取BRV VP7的保守序列，應(yīng)用Primer explorer V4設(shè)計了針對該序列保守區(qū)域的外引物和內(nèi)引物，通過對反應(yīng)體系、反應(yīng)時間、靈敏度、特異性的優(yōu)化，建立了一種針對BRV的RT－LAMP快速檢測方法。該方法能特異的檢測BRV，并且表現(xiàn)較高的靈敏度，是常規(guī)RT－PCR的100倍。其靈敏度與Imai M等［11］建立的針對H5亞型的高致病性 AIV的 RT－LAMP檢測方法和 Chen H T等［12］針對PRRSV建立的RT－LAMP檢測方法的靈敏度相當(dāng)。而且整個反應(yīng)只需要在水浴鍋中50 min即可完成，真正實現(xiàn)了無需貴重儀器的檢測。并且，通過加入熒光染料SYBR Green I，實現(xiàn)了 RT－LAMP技術(shù)的可視性。同時，本研究過程表明，RT－LAMP檢測技術(shù)無需單獨的逆轉(zhuǎn)錄，只需一步即可完成對靶序列的擴增，沒有核酸的變性復(fù)性過程；在等溫條件下進行擴增，不僅節(jié)省時間和成本，更重要的是減少了RNA酶和擴增核酸的污染機會。如果將該方法進一步優(yōu)化和完善，實現(xiàn)多重檢測，將會在犢牛腹瀉的早期診斷及預(yù)防控制方面發(fā)揮重要作用。

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