張文奎，趙紅艷，龍 淼，郭 洋，王鳳龍

（1.內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院，內蒙古呼和浩特010018；2.沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽110866；3.本溪市動植物園管理辦公室，遼寧本溪117000）

犬瘟熱是由犬瘟熱病毒（CDV）引起的烈性、高致死性傳染?。?］，易感動物包括犬科、浣熊科、貓科、海豹科等［2］。除了犬之外，我國北方飼養(yǎng)的毛皮動物狐貍、貉、貂都是犬瘟熱病毒的易感動物，此病對皮毛獸養(yǎng)殖造成很大危害。一旦養(yǎng)殖戶因未及時給動物接種疫苗而造成發(fā)病，往往引起大群死亡［3］。即使在疫苗廣泛使用的前提下，還會經常出現犬瘟熱發(fā)生。因此，早期診斷是防治犬瘟熱的重要前提。目前對于犬瘟熱的診斷有了大量的報道，但對于采用HE及免疫組化的方法進行犬瘟熱病毒的組織定位研究報道很少。雖然一些報道描述了該病毒存在于一些有限的器官，如肺、腦、腎、腸道、腳墊、淋巴器官［4－5］，但CDV在貉的各個組織中的分布規(guī)律及究竟哪些組織器官最適宜進行病理學診斷還尚未有人研究。本研究采用HE染色方法對犬瘟熱感染的病貉進行CDV組織包涵體檢測，并采用免疫組化方法證明貉發(fā)生犬瘟熱時CDV在組織臟器中的分布規(guī)律，進而確定哪些織器官最適宜于進行犬瘟熱診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 2010年－2011年，在遼寧地區(qū)共搜集到犬瘟熱確診病貉79只，患貉病程從1周到1個月不等。根據臨床癥狀懷疑為犬瘟熱，經過問診，這些病貉沒有被注射過疫苗，表現的臨床癥狀多種多樣，包括鼻腔有大量分泌物、咳嗽、肺炎、腹瀉、結膜炎、結痂、硬足墊及神經綜合征。剖檢的主要癥狀是肺炎，腸炎，脾、胸腺、淋巴結萎縮。通過犬瘟熱免疫試紙條法確診所搜集的貉為犬瘟熱病貉。

1.1.2 樣本采集 犬瘟熱病貉的肺、腦、腎、胃、脾、淋巴結、扁桃體、鼻、足墊、支氣管。

1.1.3 試劑與儀器 犬瘟熱單克隆抗體（美國維爾康WELLCAN）為北京寵必威生物科技有限公司產品；DAB顯色劑為北京博奧森生物技術有限公司產品；抗原修復液、封閉用羊血清、抗體稀釋液和山羊抗小鼠IgG抗體－HRP多聚體二抗為北京中杉金橋生物技術有限公司產品；QPJ－1B切片機為天津天利航空機電有限公司產品；OLYMPUS顯微鏡為廣州思貝舒檢測儀器公司產品；PAP筆（ZLI－9070）和防脫磨砂載玻片為北京中杉金橋生物技術有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 切片制作 將固定于100 mL／L中性福爾馬林溶液中的肺、腦、腎、胃、脾、各種淋巴結、扁桃體、腳墊、鼻常規(guī)石蠟包埋制塊，切片（3μm），撈于防脫磨砂載玻片上，50℃烤片5 h，37℃溫熱過夜。

1.2.2 HE染色 根據王鳳龍編寫的動物病理及檢驗技術中HE染色步驟進行［6］。

1.2.3 免疫組化染色 石蠟切片脫蠟至水：二甲苯Ⅰ15 min；二甲苯Ⅱ10 min；1 000 mL／L乙醇Ⅰ5 min；1 000 mL／L乙醇Ⅱ5 min；950 mL／L乙醇5 min；900 mL／L 乙 醇 5 min；700 mL／L 乙 醇5 min，蒸餾水沖洗2 min×3次，PBS液浸泡5 min×3次；擦掉切片上組織周圍的液體，用PAP筆在組織周圍劃圈，放入底部盛有PBS的濕盒中，滴加30 mL／L H2O2阻斷劑于組織上，室溫避光孵育20 min，PBS液沖洗，5 min×3次；血清封閉：羊血清工作液滴加在組織上，37℃孵育30 min，甩掉血清，勿沖洗；滴加抗體稀釋液1∶100稀釋的犬瘟熱單克隆抗體，4℃過夜（14 h以上）；陰性對照加PBS；37℃復溫45 min，PBS洗，5 min×3次；滴加山羊抗小鼠IgG抗體－HRP多聚體二抗，37℃孵育60 min，PBS沖洗，5 min×3次；DAB顯色：先將DAB試劑中的A液一滴加入1 mL蒸餾水中混勻，再加入1滴B液和1滴C液混勻使用，現用現配。滴加在組織上顯色3 min～10 min，顯微鏡下控制顯色；切片入蒸餾水，再用自來水沖洗終止顯色；蘇木素復染：在蘇木素中染色4 min；自來水沖洗，蒸餾水浸泡；鹽酸酒精分化；自來水泛藍20 min；酒精梯度脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片。

2 結果

免疫組化法檢測犬瘟熱病毒在犬瘟熱病貉體內的分布規(guī)律如圖1所示，所檢測病貉共79只，在病貉各個組織器官檢測到犬瘟熱病毒的比例如下：在肺部占72%，大腦占24%，膀胱占74%，胃占80%，脾占77%，淋巴結占80%，扁桃體占100%，足墊占89%，鼻黏膜占87%，支氣管占90%。表明CDV在犬瘟熱病貉扁桃體分布最廣，在其他組織器官也有廣泛的分布。

圖1 免疫組化法檢測犬瘟熱病毒在貉組織器官的分布比例Fig.1 Distribution rate of canine distemper virus in the various tissues of the raccoon dogs

在光鏡下觀察HE染色組織切片，發(fā)現在腎小管上皮細胞中包涵體成紅染圓形團塊（圖2A），小腦顆粒層細胞內見包涵體為卵圓形紅染團塊（圖2B），肺泡壁細胞內出現卵圓形紅染團塊包涵體（圖2C），在脾臟，淋巴細胞減少，在網狀內皮細胞內可見嗜酸性包涵體（圖2D）。免疫組化結果表明，除了上述器官之外，在足墊顆粒層細胞內有陽性著色顆粒（圖3A），鼻頭顆粒層細胞與角質層內有散在陽性信號（圖3B），支氣管上皮細胞胞漿內見強陽性信號（圖3C），扁桃體網狀內皮細胞出現強陽性信號（圖3D）。淋巴器官變化很大，主要是扁桃體、脾臟和淋巴結顯著萎縮并伴有淋巴數量減少，嗜酸性胞內包涵體在網狀內皮細胞和淋巴細胞內大量出現。

3 討論

死后檢測CDV是確定犬瘟熱感染最準確的方法。由于CDV的自然親嗜細胞是上皮細胞，因此以前的研究中，胃黏膜、眼結膜、腎黏膜被認為是檢測CDV最可靠的器官［7］。但在我們的研究結果顯示的是包涵體在扁桃體的檢出率要高于其他器官。居于第二位的是呼吸系統(tǒng)的各個器官。CDV在淋巴組織復制并經由被感染的淋巴細胞傳播到其他組織。由于自然傳播途徑是經過吸入途徑［1，8］，病毒的復制應該首先在呼吸道的淋巴組織細胞進行。因此，CDV 能在扁桃體早期階段檢測到［1，9］。CDV 感染在早期階段可引起淋巴組織中的T細胞和B細胞顯著減少，這和其他麻疹病毒屬的病毒如（麻疹病毒、牛瘟病毒）傳染的特點一樣［10］。事實上，很多研究支持這樣的傳染過程［1，9］，并且大量的 CDV 在早期直至晚期都可以存在淋巴器官，而且在淋巴器官內檢測到，尤其是扁桃體［11］。

本試驗也進行了HE組織學檢驗，觀察包涵體的存在，但該方法沒有免疫組化法敏感，采用HE染色沒有在足墊上皮細胞和鼻頭上皮細胞檢測到包涵體，但是采用免疫組化的方法確定了CDV病毒在此部位的存在。而且有文獻報道，采用免疫組化的方法對足墊上皮細胞及鼻頭上皮細胞CDV的檢測，是對犬瘟熱生前診斷的最佳組織［12］。

本研究采用免疫組化法確定了CDV在犬瘟熱病貉組織的分布特點，為病理組織學確診貉犬瘟熱診斷提供參考。本研究結果表明最適宜確診貉犬瘟熱的病理組織學檢查器官是扁桃體。

圖2 HE染色組織切片，光鏡下觀察Fig.2 HE staining sections under light microscopy

圖3 免疫組化法檢測犬瘟熱病毒在貉部分器官中的分布Fig.3 The distribution of CDV in tissue samples by immunlhistochemistry detection

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