李勝斌，危艷武，唐青海，吳洪麗，劉建波，郭龍軍，王一平，劉 丹，劉長明

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001）

豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）可引發(fā)嚴(yán)重的繁殖障礙性疾病，初產(chǎn)母豬被感染后臨床主要表現(xiàn)為不孕、流產(chǎn)、少產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、畸形胎及弱仔等癥狀；仔豬和母豬被感染通常沒有明顯癥狀，但其體內(nèi)很多組織器官均有病毒存在［1］。該病毒于1966年首次發(fā)現(xiàn)，1967年Cartwright F等［2］證明了其致病性。此后，許多養(yǎng)豬國家均有流行，豬群中病毒陽性檢出率很高［1］。我國自20世紀(jì)80年代分離到PPV，流行病學(xué)調(diào)查證實(shí)豬群中該病毒的血清抗體陽性率達(dá)85%以上［3］。豬圓環(huán)病毒2型（PCV－2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的主要病原，該病于1991年在加拿大西部首次發(fā)現(xiàn)［4］，對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［5－7］。有研究表明，PPV與PCV－2的混合感染是導(dǎo)致PMWS的主要原因。Choi C等［8］在有PMWS病例中檢測到了 PPV；Allan G M 等［9］通過 PCV－2與PPV共感染試驗(yàn)豬成功地復(fù)制出PMWS病癥。由此可見，PPV與其他病原體協(xié)同感染的致病性應(yīng)引起重視。

PPV屬于細(xì)小病毒科（Parvoviridae），細(xì)小病毒屬（Parvovirus），是一種自主復(fù)制型病毒，無囊膜，外觀呈圓形或六角形，病毒粒子直徑約21 nm，20面體等軸對(duì)稱。實(shí)心的病毒粒子在CsCl中的浮密度為1.39 g／mL，空心的為1.30 g／mL［1］。該病毒的基因組為單股線性DNA，大小約5 kb［10］，分別編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2、VP3）和3種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3）。鑒于我國臨床上PPV與PCV－2混感情況十分普遍，兩種病毒間的協(xié)同致病性尚不清楚，二聯(lián)疫苗也未見報(bào)道。本研究在PCV－2疫苗研制成功的基礎(chǔ)上，從臨床流產(chǎn)病料中分離到一株病毒，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、免疫過氧化物酶單層細(xì)胞染色試驗(yàn)（IPMA）、免疫電鏡、核酸序列分析等方法，證實(shí)該分離毒株為PPV。此后經(jīng)細(xì)胞連續(xù)傳代，獲得一株細(xì)胞培育適應(yīng)毒株。本研究為開展PPV與PCV－2協(xié)同致病性研究及聯(lián)苗的開發(fā)開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 初產(chǎn)母豬流產(chǎn)胎兒的淋巴組織。

1.1.2 細(xì)胞 豬睪丸傳代細(xì)胞系（ST）由國外引進(jìn)，經(jīng)PCR檢測無PCV、PPV和支原體污染。

1.1.3 主要試劑 細(xì)胞培養(yǎng)液 MEM為清大天一公司產(chǎn)品；犢牛血清（FBS）為PAA公司產(chǎn)品；D－氨基葡萄糖為Sigma公司產(chǎn)品；提取總DNA所用酚－氯仿為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶－葡萄球菌A蛋白標(biāo)記物（HRPSPA）為Zymed公司產(chǎn)品；KOD－Plus高保真PCR擴(kuò)增試劑盒為Toyobo公司產(chǎn)品；PPV陽性參考血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和PCV－2陽性參考血清均由中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所相關(guān)課題組提供。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 按GenBank登錄的PPV參考序列 （NC001718，HM031134，GU978967，GU978965，EU790642，EU790641），采用 Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)PPV NS1基因的特異性引物序列。上游引 物 F129：5′－CATTGGCGTAAAAGAGGCGGGAA－3′，下游引物 R2679：5′－TGGTTGTTGAGATGTAGTTGGTGAG－3′，擴(kuò) 增 的 目 的 片 段長度2 550 bp，引物合成由北京六合華大基因科技公司進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 病料處理 取母豬流產(chǎn)胎兒的淋巴組織病料研磨成100 g／L乳劑，加入MEM細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋，加入等體積氯仿振蕩處理10 min，經(jīng)4 000 r／min離心30 min取上清，0.22μm微孔濾膜除菌，置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 采用無外源病毒和支原體污染的豬睪丸傳代細(xì)胞系（ST）進(jìn)行病毒分離，細(xì)胞培養(yǎng)液為MEM，添加50 mL／L滅活犢牛血清，青霉素、鏈霉素各100單位／mL，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)傳代。

1.2.3 病毒傳代 將處理的病料乳劑，按100 mL／L同步接種到新消化的ST細(xì)胞懸液中，置體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，吸出上清液，更換無血清的MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)96 h～120 h，收取病毒培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，以此為毒種同步接種ST細(xì)胞盲傳3代。采用IPMA法測定病毒含量。

1.2.4 血清學(xué)鑒定 采用IPMA法檢測感染細(xì)胞中的病毒抗原，包括PPV、CSFV、PRRSV、PCV－2、PRV和TGEV，具體程序按文獻(xiàn)［11］進(jìn)行。

1.2.5 病毒含量測定 取不同代次的病毒培養(yǎng)物，作10倍系列稀釋，同步接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的細(xì)胞，每個(gè)稀釋度設(shè)4孔，同設(shè)不加病毒的健康細(xì)胞作對(duì)照，置體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，37℃靜置培養(yǎng)，接種病毒72 h后固定細(xì)胞，采用IPMA法檢測各孔細(xì)胞的病毒感染情況，按Reed－Muench法計(jì)算半數(shù)細(xì)胞感染量（TCID50／mL）。

1.2.6 D－氨基葡萄糖對(duì)病毒增殖的影響 取病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)物，分別按100、50、20、10、5、1 mL／L比例同步接種新消化的ST細(xì)胞懸液，同時(shí)添加D－氨基葡萄糖組（10 g／L）與未添加組，置體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中，37℃靜置培養(yǎng)24 h，吸出上清液，更換無血清的MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)96 h，收取病毒培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次。采用IPMA法測定病毒含量。

1.2.7 免疫電鏡觀察 取病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)物，PBS洗滌細(xì)胞3次，預(yù)留0.5 mL PBS凍融3次，12 000 r／min離心20 min，取上清，加入終濃度為10 mL／L的PPV陽性血清，混合，4℃感作過夜，12 000 r／min離心20 min，其沉淀物用0.1 mL的PBS液溶解，20 g／L磷鎢酸液（p H6.8）負(fù)染制樣，電鏡觀察病毒免疫復(fù)合物。

1.2.8 病毒增殖動(dòng)力學(xué)測定 取病毒培養(yǎng)物按10 mL／L的接毒劑量，接種于單層ST細(xì)胞，置體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃靜置培養(yǎng)，于接毒后4、8、12、16、24、36、48、60、72、84、96、120 h 固 定 細(xì)胞，采用IPMA法檢測各孔細(xì)胞的病毒感染情況。

1.2.9 病毒DNA提取和PCR擴(kuò)增 按常規(guī)方法［11］提取病毒DNA作為PCR模板，采用KODPlus高保真PCR擴(kuò)增試劑盒（Toyobo產(chǎn)品，杭州）進(jìn)行DNA擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為：94℃2 min；94℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.10 核苷酸序列測定 將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆至p GM－T載體（天根生化科技有限公司），取純化的重組質(zhì)粒送北京六合華大基因科技股份有限公司測序，采用DNAMAN和MEGA 4軟件進(jìn)行序列分析與比對(duì)。

1.2.11 病毒回歸動(dòng)物試驗(yàn) 選用35日齡非免疫健康仔豬10頭，經(jīng)PPV抗體和抗原檢測為陰性，取第50代病毒培養(yǎng)物（107.2TCID50／mL）經(jīng)肌肉注射和滴鼻途徑接種5頭豬，每頭肌肉注射1 mL，同時(shí)滴鼻1 mL，其余5頭豬設(shè)為未接種對(duì)照組。試驗(yàn)豬隔離飼養(yǎng)，逐日觀察臨床反應(yīng)，測定直腸溫度，每周稱量體重并采血。試驗(yàn)豬于攻毒后28 d處死，取心、肝、脾、肺、腎、扁桃體、腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、下頜淋巴結(jié)和小腸的組織病料做病理學(xué)觀察，利用PCR法檢測病毒核酸。

2 結(jié)果

2.1 毒株培育

分離的PPV－HJ毒株經(jīng)ST細(xì)胞傳至第10代，病毒感染細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變（CPE），病變細(xì)胞呈現(xiàn)圓縮、變形和脫落，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)包涵體（圖1B），未接種病毒對(duì)照細(xì)胞無明顯變化（圖1A）。病毒經(jīng)細(xì)胞傳25代后，其在細(xì)胞上的適應(yīng)性顯著增強(qiáng)，第40～50代增殖能力達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

2.2 血清學(xué)鑒定結(jié)果

取PPV－HJ株第50代培養(yǎng)物感染ST細(xì)胞，經(jīng)固定后進(jìn)行IPMA法檢測，結(jié)果如圖2。病毒感染細(xì)胞呈棕紅色，且核區(qū)較深，病毒抗原主要集中在細(xì)胞核區(qū)，細(xì)胞質(zhì)中也有分布。感染病毒細(xì)胞與其他幾種病毒陽性參考血清（CSFV、PRRSV、PCV－2、PRV和TGEV）無交叉反應(yīng)，表明不存在這些病毒污染。

2.3 免疫電鏡觀察結(jié)果

取第50代病毒培養(yǎng)物，進(jìn)行免疫電鏡觀察，可見形態(tài)均一的病毒粒子與抗體結(jié)合形成的免疫復(fù)合物，單個(gè)病毒粒子直徑約21 nm，未見有其他外源病毒粒子混入（圖3）。

圖3 PPV－HJ毒株免疫電鏡觀察Fig.3 Observation of PPV－HJ strain by immuno－electron microscope

2.4 傳代毒病毒含量測定

PPV－HJ毒株經(jīng)ST細(xì)胞傳代，每5代取樣測定病毒含量。該分離株在培養(yǎng)初期毒價(jià)較低，經(jīng)細(xì)胞傳代后毒價(jià)明顯升高，尤以第40～50代，毒價(jià)穩(wěn)定在107.2TCID50／mL，表明分離毒株已經(jīng)適應(yīng)體外細(xì)胞培養(yǎng)，能夠保持良好的增殖性能。此外，我們驗(yàn)證了添加D－氨基葡萄糖對(duì)PPV－HJ株增殖的影響，添加組與未添加組毒價(jià)測定結(jié)果表明，該物質(zhì)添加對(duì)病毒增殖具有明顯的促進(jìn)作用（圖4）。

圖4 添加D－氨基葡萄糖對(duì)PPV－HJ毒株毒價(jià)的影響Fig.4 Effect of D－glucosamine on the titers of PPV－HJ strain

2.5 病毒基因序列分析

從PPV－HJ毒株第50代培養(yǎng)物提取病毒核酸，以PPV NS1基因特異性引物擴(kuò)增第129位～2 679位核苷酸序列，擴(kuò)增結(jié)果見圖5，片段大小與預(yù)期一致。核苷酸序列分析表明，該毒株的NS1基因序列與GenBank登錄的PPV－ZJ毒株（EU790642）序列相似性最高，其相似性達(dá)98.41%。此外，PPV－HJ毒株NS1基因序列與GenBank下載的其他13株P(guān)PV 序 列：China 株 （AY583318）、SR－1 株（DQ675456）、NADL2 株 （NC＿001718）、Kress株（U44978）、YL 株 （JN860197）、Challenge 株（AY684866）、BQ 株 （EU790641）、PPV2010（JN 8 7 2 4 4 8）、N株 （HM 9 8 9 0 0 9）、VRI－1株（AY390557）、ZJ 株 （EU790642）、Nanjing 200801（FJ822038）和IDT 株（AY684872），繪制了 PPVNS1基因序列遺傳進(jìn)化樹（圖6）。在該遺傳進(jìn)化樹中，IDT株（AY684872）單獨(dú)形成一個(gè)進(jìn)化分支。PPV－HJ株與中國的ZJ株（EU790642）和Nanjing 200801（FJ822038）處于同一個(gè)進(jìn)化分支內(nèi)（Group 1），其他毒株共同形成一個(gè)大的進(jìn)化分支（Group 2）。

2.6 病毒增殖動(dòng)力學(xué)測定

取PPV－HJ毒株第50代病毒接種細(xì)胞，對(duì)病毒感染細(xì)胞不同時(shí)間增殖動(dòng)力學(xué)測定結(jié)果表明（圖7），病毒接種后16 h能夠檢測到病毒感染陽性細(xì)胞，表明成熟的病毒粒子裝配成功；24 h～36 h病毒感染陽性細(xì)胞逐漸擴(kuò)散增多，表明子代病毒從細(xì)胞出芽釋放；48 h～72 h病毒繁殖達(dá)到高峰，幾乎所有細(xì)胞均被病毒感染；84 h～120 h，病毒感染細(xì)胞呈現(xiàn)圓縮、破碎、脫落，后期感染的陽性細(xì)胞仍可貼壁。

圖7 PPV－HJ毒株感染ST細(xì)胞增殖規(guī)律的測定Fig.7 Determination of propagation rule of PPV－HJ strain in the ST cells

2.7 病毒回歸動(dòng)物試驗(yàn)

PPV－HJ毒株接種試驗(yàn)豬未見有明顯的臨床反應(yīng)，也未出現(xiàn)發(fā)熱癥狀；病毒接種后第7天可檢測到病毒血癥，持續(xù)到試驗(yàn)豬被處死。病毒接種后第14天可檢測到血清抗體，持續(xù)到迫殺，但抗體效價(jià)較低（1∶50）。在試驗(yàn)過程中，未攻毒對(duì)照組試驗(yàn)豬無臨床反應(yīng)，PPV抗原與抗體檢測均呈陰性結(jié)果。病毒接種28 d后處死試驗(yàn)豬，攻毒組豬各臟器未出現(xiàn)眼觀可見病變，也未觀察到明顯的組織病理學(xué)變化。采用PCR方法對(duì)攻毒組豬的心、肝、脾、肺、腎、扁桃體、腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、下頜淋巴結(jié)和小腸進(jìn)行了病毒核酸檢測。結(jié)果顯示，攻毒組豬的肺臟、扁桃體、腹股溝淋巴結(jié)、下頜淋巴結(jié)、小腸中病毒的檢出率顯著高于心、肝、脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)的檢出率，結(jié)果如表1所示。未攻毒對(duì)照組試驗(yàn)豬全部臟器均為PPV核酸陰性。

表1 PCR檢測PPV－HJ病毒株人工感染試驗(yàn)豬組織中PPV核酸分布Table1 PCR test for the PPV nucleic acid distribution in organic samples from the experimentally infected pigs

3 討論

本研究從臨床病例中成功地分離到一株P(guān)PV，經(jīng)過細(xì)胞傳代培育成細(xì)胞適應(yīng)毒株，命名為PPVHJ毒株。在病毒分離過程中，由于病料中存在多種病原，給PPV的分離帶來了一定困難，本研究采用氯仿處理，將有囊膜的病毒去除，使之喪失對(duì)細(xì)胞的感染性，這樣就可排除如CSFV、PRV等的干擾，有效地減少初代次病毒接種細(xì)胞時(shí)不良影響，提高病毒分離的成功率。有研究表明，PPV在ST細(xì)胞上的適應(yīng)性和感染性最佳，且復(fù)制能力最強(qiáng)［12］。因此，本試驗(yàn)選擇了ST細(xì)胞系對(duì)PPV－HJ毒株進(jìn)行體外培養(yǎng)和傳代。由于PPV的初代培養(yǎng)物感染ST細(xì)胞不出現(xiàn)細(xì)胞病變，所以檢測病毒感染細(xì)胞中的抗原十分重要。本研究采用IPMA法檢測病毒在感染細(xì)胞中抗原，可反映病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的增殖情況。研究表明，該方法具有操作簡便，抗原定位準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適用于病毒的定性和定量檢測。隨著PPV傳代次數(shù)的遞增，感染ST細(xì)胞開始出現(xiàn)CPE，同時(shí)病毒滴度也逐漸增加并趨于穩(wěn)定。病毒增殖動(dòng)力學(xué)表明，接種病毒后16 h能夠檢測到PPV感染陽性細(xì)胞，表明成熟的病毒粒子裝配成功；24 h～36 h病毒感染陽性細(xì)胞逐漸擴(kuò)散增多，表明子代病毒從細(xì)胞出芽釋放；48 h～72 h病毒增殖達(dá)到高峰，幾乎所有細(xì)胞均被病毒感染；84 h～120 h，病毒感染細(xì)胞呈現(xiàn)圓縮、破碎、脫落，后期感染的陽性細(xì)胞仍可貼壁。由于PPV粒子較小，常規(guī)電鏡負(fù)染法觀察不易確認(rèn)，采用免疫電鏡方法觀察病毒免疫復(fù)合物，獲得了滿意的病毒形態(tài)學(xué)鑒定效果，觀察到的PPV粒子大小及形態(tài)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［1］。

從病毒基因組序列分析結(jié)果看，PPV－HJ株的NS1基因與GenBank登錄的PPV－ZJ毒株（EU790642）的NS1基因相似性最高，基于PPVNS1基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上，PPV－HJ株與中國的ZJ株（EU790642）和 Nanjing 200801（FJ822038）共同處于同一個(gè)較大的進(jìn)化分支內(nèi)，這一結(jié)果表明，PPV－HJ株很可能是由中國本地的PPV毒株經(jīng)過自然選擇演化而來的。有報(bào)道證實(shí)，PPV在多數(shù)細(xì)胞處于旺盛的有絲分裂期接種病毒最佳，這個(gè)時(shí)期許多細(xì)胞處于S期，即DNA合成期，細(xì)胞中的DNA聚合酶能夠促進(jìn)病毒復(fù)制［1］。因此，本試驗(yàn)采用病毒同步接種細(xì)胞進(jìn)行傳代，目的在于使病毒復(fù)制能夠有效利用宿主細(xì)胞的酶類。Tischer I等［13］通過對(duì)PCV培養(yǎng)特征發(fā)現(xiàn)，D－氨基葡萄糖處理可顯著增強(qiáng)病毒的增殖能力，這可能是由于該物質(zhì)能夠提高宿主細(xì)胞S期合成的DNA聚合酶量，或延長該聚合酶合成時(shí)間，其機(jī)制尚未闡明。本研究對(duì)PPV－HJ毒株感染的細(xì)胞中添加10 g／L的D－氨基葡萄糖，從結(jié)果看，處理后能夠顯著提升子代病毒滴度，表明該物質(zhì)可促進(jìn)PPV的增殖。

動(dòng)物感染試驗(yàn)表明，該毒株接種試驗(yàn)豬，其體溫保持正常，未表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，這與先前報(bào)道基本一致［9，14］。該毒株接種后第7天能檢測到病毒血癥，第14天檢測到血清抗體，病理學(xué)觀察表明，感染豬臟器未觀察到明顯的病理變化，然而，采用PCR法在多種臟器中均檢出有本病毒核酸存在，證明本試驗(yàn)培育的PPV－HJ毒株對(duì)易感動(dòng)物仍具有感染性。國外相關(guān)報(bào)道證明，PCV－2與PPV混合感染可引起豬產(chǎn)生典型的 PMWS癥狀［9，14－15］，PPV 單獨(dú)感染能夠引起嚴(yán)重的繁殖障礙性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。為此，本研究獲得的PPV毒株，為今后開展PPV與PCV－2共感染的致病機(jī)理的研究，以及聯(lián)合疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

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