胡曉丞，李亞洲，高 沖，佟繼銘，張樹峰

(承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所，河北承德 067000)

大黃為臨床常用中藥之一，為廖科植物掌葉大黃(Rheum palmatum L)、唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim Ex Balf)或藥用大黃(Rheum officinale Bail)的干燥根及根莖，味苦、性寒，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)[1]。現(xiàn)代研究表明，大黃含有蒽醌類、多糖類、鞣質(zhì)類等成分，具有瀉下、收澀、止血、抗菌、抗病毒、延緩衰老等作用[2]。據(jù)統(tǒng)計，約有800多種中藥制劑中含有大黃，一般認(rèn)為大黃毒性較低，臨床應(yīng)用比較安全。但大多數(shù)降脂減肥、排毒養(yǎng)顏類中成藥也含有大黃，以致應(yīng)用大黃的時間過長，導(dǎo)致大黃相關(guān)的不良反應(yīng)發(fā)生率增高[3]。有文獻(xiàn)報道，大黃可使小鼠及金黃地鼠睪丸精曲小管上皮的生精細(xì)胞發(fā)生斷脫，金黃地鼠和大鼠的性器官萎縮[4-5]。但未見大黃對性器官的毒性反應(yīng)與應(yīng)用大黃劑量關(guān)系的報道。本研究采用竹梅等[6]的方法對大黃產(chǎn)生的生殖毒性與劑量之間的關(guān)系進(jìn)行實驗研究，為臨床安全用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器 大黃，安國市長安中藥材有限公司，批號:20090902，經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所劉翠哲研究員鑒定為掌葉大黃的干燥根莖。STP120自動組織處理機(jī)、171型組織自動包埋機(jī)，美國Thermo Electron Corporation;TK-218型恒溫攤片烤片機(jī)，湖北泰維醫(yī)療科技有限責(zé)任公司。

1.2 實驗動物分組及處理 清潔級8周齡雄性昆明種小鼠40只，購自天津市山川紅實驗動物科技有限公司，許可證號:SCXK(津)2009-0001。40只小鼠隨機(jī)分為空白對照組和大黃大、中、小劑量組，每組10只。大黃大、中、小劑量組小鼠分別給予2、1、0.5g/kg生藥量的大黃水提物灌胃，連續(xù)30d。

1.3 大黃水提取物的制備 大黃藥材粉碎為粗粉，10倍水浸泡兩次，合并提取液，過濾，40℃濃縮至生藥量含量為0.2g/ml備用。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 觀察小鼠一般狀況:觀察給藥期間實驗小鼠的活動、步態(tài)、行為等一般狀況;分別于給藥前、后測量小鼠體重(g)，觀察小鼠體重增長情況:體重增長(%)=(用藥后體重-用藥前體重)/用藥前體重。

1.4.2 計算睪丸指數(shù):小鼠用藥結(jié)束稱重后處死剖取雙側(cè)睪丸，冷生理鹽水沖洗除去血液，濾紙吸干，稱重(帶附睪)，并計算睪丸指數(shù):睪丸指數(shù)(%)=雙側(cè)睪丸(帶附睪)重量/體重[7]。

1.4.3 觀察睪丸的形態(tài)結(jié)構(gòu):睪丸稱重后10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚4μm，HE染色觀察睪丸的形態(tài)結(jié)構(gòu)并攝片。

1.5 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況 空白對照組小鼠未出現(xiàn)水樣便，活動敏捷，步態(tài)、行為及對外界反應(yīng)情況均正常，未見死亡。大黃大、中、小劑量組小鼠均出現(xiàn)水樣便，其中大劑量組水樣便最為嚴(yán)重、小鼠反應(yīng)略減遲緩，3周后水樣便情況緩解，三組均未見死亡。大黃三個劑量組小鼠體重增長百分率均明顯低于空白對照組小鼠，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05);大黃三個劑量組之間比較，大劑量組小鼠體重增長率與小劑量組、中劑量組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05)。見附表。

附表 大黃水提物對小鼠體重和睪丸指數(shù)的影響(n=10±s)

附表 大黃水提物對小鼠體重和睪丸指數(shù)的影響(n=10±s)

與空白對照組比較:*P＜0.01，**P＜0.05;與大劑量組比較:#P＜0.01，##P＜0.05

組別 體重 睪丸指數(shù)(%)初始體重(g) 結(jié)束體重(g) 體重增長(%)空白對照組 21.60±1.26 34.49±3.27 0.37±0.07 1.07±0.09大黃小劑量組 23.20±1.99 29.86±3.03 0.22±0.07*## 1.07±0.15##大黃中劑量組 20.80±1.14 30.29±1.91 0.30±0.05**# 0.86±0.17*#大黃大劑量組 22.20±2.30 25.55±1.84 0.13±0.09* 0.94±0.11**

2.2 大黃水提物對小鼠睪丸指數(shù)的影響 大黃中、大劑量組小鼠的睪丸指數(shù)明顯低于空白對照組小鼠，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05);大黃三個劑量組之間比較，大劑量組小鼠睪丸指數(shù)明顯低于大黃小劑量組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見附表。

2.3 小鼠睪丸的形態(tài)結(jié)構(gòu) 對照組小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，生精小管基膜連續(xù)、完整，各級生精細(xì)胞形態(tài)正常，排列規(guī)則，支持細(xì)胞形態(tài)典型(附圖A)。大黃小劑量組小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞仍可見，生精小管基膜開始出現(xiàn)斷裂，各級生精細(xì)胞仍可見(附圖B);中劑量組小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞部分消失，生精小管基膜大部分出現(xiàn)斷裂，生精小管管腔不規(guī)則，生精細(xì)胞排列紊亂，生精細(xì)胞層數(shù)減少，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清(附圖C);大劑量組小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞完全消失，生精小管基膜斷裂或缺失，生精細(xì)胞部分消失(附圖D)。

附圖 小鼠睪丸HE染色結(jié)果(×100)

3 討論

大黃為中醫(yī)臨床常用藥，由于近年來的不當(dāng)使用，不良反應(yīng)發(fā)生率明顯增高，本研究旨在觀察大黃對雄性小鼠睪丸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響及與用藥劑量的關(guān)系。

睪丸是雄性生殖系統(tǒng)的重要組成部分，其生精小管的管壁有不同發(fā)育階段的各級生精細(xì)胞按順序排列，分別為精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和分化中的精子，直至成熟精子脫離支持細(xì)胞(Sertoli細(xì)胞)進(jìn)入管腔。睪丸的功能主要包括兩個方面，一是精曲小管上皮產(chǎn)生精子，二是間質(zhì)細(xì)胞分泌雄性激素—睪酮。睪酮的主要作用是促進(jìn)雄性生殖器官的發(fā)育和第二性征的形成;另外，睪酮還對精子發(fā)生、精子成熟以及體內(nèi)物質(zhì)代謝起一定的作用;同時，睪酮還可以通過刺激中樞維持正常性欲。如果睪丸萎縮，可引起睪丸生精功能障礙，出現(xiàn)少精子癥或無精子癥，造成男性不育;睪丸萎縮還可使睪酮水平降低，必然會影響性欲和性功能。睪丸指數(shù)的變化可較好反映藥物對睪丸毒性的總體情況，也是尋找藥物毒性作用靶器官的重要線索[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，大黃中劑量組、大劑量組小鼠睪丸指數(shù)明顯低于空白對照組，說明大黃生殖毒性確實存在，且靶器官可能是睪丸。本研究HE染色結(jié)果表明，大黃對睪丸間質(zhì)細(xì)胞的損害較重，且各劑量大黃對間質(zhì)細(xì)胞的損害程度不同，中、大劑量尤為明顯。本研究證明大黃水提物對小鼠睪丸確實存在毒性損傷，為進(jìn)一步確定大黃毒性作用的靶器官及作用機(jī)制的研究提供了實驗依據(jù)。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].2005版第一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.17-18.

[2]高學(xué)敏.中藥學(xué)(上冊)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2009.595-607.

[3]曹俊嶺，孫玉琦，肖小河，等.對大黃“毒性”的認(rèn)識與思考[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，2(2):112-114.

[4]苗明三，王燦.中藥對生殖系統(tǒng)毒性的研究分析[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19(2):284-285.

[5]沈丕安.中藥不良反應(yīng)與臨床[M].第1版.上海:第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，2007.275-276.

[6]竹梅，張會軍，王莎莉.青蒿水提物對雄性小鼠一般生殖毒性的實驗研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，35(7):1029-1031.

[7]王心如.毒理學(xué)基礎(chǔ)[M].第4版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003.119.

[8]劉雁，吳純啟，施暢，等.新藥生殖毒性實驗規(guī)范性操作介紹[J].藥物評價研究，2010，33(1):19-21.

[9]張才田，王雪松，胡雪玲，等.雷公藤多苷抑制大鼠精子發(fā)生的研究[J].南京生殖醫(yī)學(xué)雜志，2008，17(2):118-122.