趙紫霞，鄧海霞，徐鵬，張研，李炯棠，孫效文

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心，北京100141;2.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023)

鯉Cyprinus carpio是世界上養(yǎng)殖范圍較廣的經(jīng)濟(jì)魚類，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)著非常重要的地位。近年來，隨著鯉基因組學(xué)和功能基因組學(xué)研究的逐步深入［1］，已測定了大量的功能基因序列、分子標(biāo)記序列、表達(dá)序列標(biāo)簽等數(shù)據(jù)，并構(gòu)建了遺傳連鎖圖譜［2］、細(xì)菌人工染色體物理圖譜［3］等，然而這些基因組序列在鯉染色體上的定位信息卻少見報道。目前，僅有5S核糖體DNA(ribosomal DNA，rDNA)［4］、重復(fù)序列 CR1［5］和生長激素轉(zhuǎn)基因片段［6］等得到定位。

45S rDNA編碼的3種核糖體RNA參與蛋白質(zhì)的合成，是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量最為豐富的基因［7］，也是基因組內(nèi)典型的中度串聯(lián)重復(fù)序列，每個重復(fù)單元由18S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(internal transcribed spacer-1，ITS-1)、5.8S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(internal transcribed spacer-2，ITS-2)和28S rDNA組成，重復(fù)單元之間被非轉(zhuǎn)錄基因間隔區(qū) (Intergenicspacer， IGS) 所 分 隔［8-9］。45S rDNA存在于所有真核生物中，拷貝數(shù)通常為數(shù)百個，不同物種間45S rDNA的染色體分布具有較大差異，因而其常被作為物種 (或品種)重要的遺傳學(xué)特征進(jìn)行研究。目前，有多個水產(chǎn)物種的45S rDNA定位信息已有報道，如櫛孔扇貝Chlamys farreri［10］、泥鰍 Misgurnus anguillicaudatus［11］、多瑙哲羅鮭Hucho hucho［12］等。本研究中，作者通過熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)，對鯉45S rDNA序列進(jìn)行染色體定位。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用魚采自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所松浦實驗基地，包括1齡散鱗鏡鯉Cyprinus carpio var.scattered mirror 5尾，1齡松浦鯉Cyprinus carpio Songpu 5尾，體長為14.7～19.2 cm，體質(zhì)量為42～106 g。

1.2 方法

1.2.1 有絲分裂中期染色體的制備 試驗魚在25℃恒溫水族箱內(nèi)暫養(yǎng)48 h后，腹腔注射植物血凝素(上海世澤生物科技有限公司)，劑量為60 μg/g(魚體質(zhì)量)。18 h后腹腔注射秋水仙素(Sigma-Aldrich)，劑量為6 μg/g(魚體質(zhì)量)。2 h后剪尾鰭放血，取腎組織，采用空氣干燥法［13］制備有絲分裂中期染色體，置于冰箱(-80℃)中保存。

1.2.2 鯉45S rDNA序列的獲取與驗證 使用CLC Genomics Workbench 4.03數(shù)據(jù)分析平臺，依據(jù)人45S rDNA內(nèi)的相對保守區(qū)域18S rDNA(NCBI Reference Sequence:NR_003286.2，下同)、5.8S rDNA(NR_003285.2)、28S rDNA(NR_003287.2)，在本課題組鯉基因組序列草圖數(shù)據(jù)庫中采用Blast軟件進(jìn)行序列同源性比對，對于命中的序列群進(jìn)行必要的重新拼接和篩選，獲得鯉45S rDNA完整序列。在該序列上設(shè)計引物 (由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，分別以散鱗鏡鯉和松浦鯉基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆，委托中美泰和生物技術(shù) (北京)有限公司測序驗證序列的準(zhǔn)確性。

1.2.3 染色體熒光原位的雜交 分別使用引物CAAG1191、CAAG3602和 CAAG1845，采用 PCR標(biāo)記探針合成試劑盒 (Roche公司產(chǎn)品)制備生物素標(biāo)記探針和地高辛標(biāo)記探針，雜交液成分為:5 ng/μL(探 針)，15 ng/μL 鮭 精 DNA(Sigma-Aldrich)，15 ng/μL 大腸桿菌 tRNA(Roche)，2 μg/μL小牛血清白蛋白(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，10%硫酸葡聚糖(Amresco)和4×SSC。按照文獻(xiàn) ［11］中的方法進(jìn)行雜交反應(yīng)。

1.2.4 熒光染色及信號的放大 對于用生物素標(biāo)記的探針雜交片，依次加入用綠色熒光染料FITC標(biāo)記的親和素 (Sigma-Aldrich)、用生物素標(biāo)記的親和素抗體 (Vector)、用FITC標(biāo)記的親和素進(jìn)行反應(yīng);對于用地高辛標(biāo)記的探針雜交片，依次加入鼠抗地高辛抗體 (Sigma-Aldrich)、用紅色熒光染料TRITC標(biāo)記的兔抗鼠抗體 (Sigma-Aldrich)、用TRITC標(biāo)記的羊抗兔抗體 (Sigma-Aldrich)進(jìn)行反應(yīng)，使用各產(chǎn)品說明書推薦劑量。每次在37℃下避光反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束后按文獻(xiàn) ［10］中的方法洗去未結(jié)合的試劑。

1.2.5 雜交信號的熒光觀察 每張載玻片上滴加50 μL 含有5 ng/μL DAPI、20 mg/mL DABCO、100 mmol/L Tris(pH 8.0)、90%甘油的熒光染色劑，室溫下放置3 min后蓋片，用甲油封片，在4℃下染色8 h后，在Imager M2熒光顯微鏡 (Zeiss)下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 45S rDNA序列及其驗證

獲得的序列全長9 426 bp，其中包含45S rDNA完整序列和非轉(zhuǎn)錄IGS的部分序列，其功能注釋見表1，序列信息已提交 GenBank，注冊號為JN628435。

由于該序列是從鯉全基因組高通量二代測序的初步組裝結(jié)果中獲取，有可能存在拼接錯誤，因此在該序列不同位置處設(shè)計引物，分別以散鱗鏡鯉和松浦鯉基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗證序列信息的準(zhǔn)確性。設(shè)計的13對引物基本均勻覆蓋該序列的大部分區(qū)域，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果均呈現(xiàn)清晰單帶 (圖1)，實際擴(kuò)增長度與預(yù)期相符，證明該序列組裝結(jié)果較為可靠。

表1 鯉基因組序列JN628435功能注釋Tab.1 Functional annotation of common carp genome sequence JN628435

為進(jìn)一步驗證序列的準(zhǔn)確性，在以散鱗鏡鯉基因組DNA為模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中選取10條進(jìn)行TA克隆，挑取單克隆進(jìn)行Sanger測序，測序結(jié)果與組裝序列的一致性均在95%以上，可轉(zhuǎn)錄區(qū)的一致性為99%或100%。擴(kuò)增引物詳細(xì)信息和目標(biāo)片段測序結(jié)果見表2。

2.2 散鱗鏡鯉和松浦鯉有絲分裂中期染色體組型

選取形態(tài)清晰、染色體分散良好的中期分裂相進(jìn)行染色體計數(shù)，結(jié)果顯示兩個品種鯉的染色體二倍數(shù)均為2n=100。散鱗鏡鯉共計數(shù)52個分裂相，其中37個分裂相染色體數(shù)目為100，其典型形態(tài)如圖2-A所示，多數(shù)染色體數(shù)目完整的分裂相核型公式符合張克儉等［14］報道的公式20m+26sm+30st+24t;松浦鯉共計數(shù)46個分裂相，其中38個分裂相染色體數(shù)目為100，其典型形態(tài)如圖2-B所示，多數(shù)染色體數(shù)目完整的分裂相核型公式符合尹洪濱［15］報道的公式30m+26sm+26st+18t。

2.3 標(biāo)記探針的制備

圖1 用于驗證序列準(zhǔn)確性的引物PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of the primers used in sequence accuracy verification

表2 用于驗證序列準(zhǔn)確性的引物信息及測序結(jié)果Tab.2 Primer information and sequencing of the primers used in sequence accuracy verification

選擇位于JN628435序列上不同區(qū)域的3對引物，以PCR方法制備用于雜交反應(yīng)的標(biāo)記探針，其中探針CAAG1191和CAAG3602使用生物素標(biāo)記，探針CAAG1845使用地高辛標(biāo)記。探針的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3，與未進(jìn)行標(biāo)記的普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相比，標(biāo)記后探針的電泳條帶有微弱滯后，表明其標(biāo)記成功，分子量增加，泳動速度下降。

2.4 通過單色FISH進(jìn)行探針的染色體定位

使用綠色熒光染料FITC對生物素標(biāo)記進(jìn)行顯色和信號放大，顯微鏡照片顯示，5.8S rDNA探針CAAG1191和IGS探針CAAG3602(圖4)在散鱗鏡鯉和松浦鯉中的定位情況相同，僅定位于一對近端著絲粒染色體的短臂末端。

2.5 通過雙色FISH進(jìn)行探針的染色體共定位

將用地高辛標(biāo)記的18S rDNA探針CAAG1845與用生物素標(biāo)記的5.8S rDNA探針CAAG1191和IGS探針CAAG3602在染色體上共定位，使用紅色熒光染料TRITC對用地高辛標(biāo)記的進(jìn)行顯色和信號放大，使用綠色熒光染料FITC對用生物素標(biāo)記的進(jìn)行顯色和信號放大，顯微鏡照片 (圖5)顯示，位于45S rDNA不同區(qū)域的3條探針在散鱗鏡鯉和松浦鯉中均定位于同一對近端著絲粒染色體的短臂末端。圖5-A、C顯示探針CAAG1845的單獨定位結(jié)果 (紅色)，圖5-B、D顯示3條探針共定位的結(jié)果，其中黃色信號由紅色的TRITC和綠色的FITC混合而成。

3 討論

3.1 45S rDNA探針的設(shè)計

國內(nèi)報道的核糖體DNA定位研究多使用包含部分目的片段的質(zhì)?？寺∽魈结槪?，11］，通過不同實驗室之間相互饋贈而獲得。由于探針獲取途徑受限，一定程度上影響了FISH技術(shù)的推廣。本研究中利用“鯉魚基因組計劃”的基因組測序組裝結(jié)果，獲得了鯉45S rDNA全長序列，依據(jù)該序列設(shè)計引物，通過PCR方法制備雜交探針，不同實驗室之間只需交流引物信息即可共享探針，有效提高了FISH技術(shù)的通用性。

曾有部分物種rDNA旁系同源現(xiàn)象存在的報道［16］，即在同一物種基因組的不同區(qū)域，存在具有同性源但不完全相同的rDNA序列，有的能夠轉(zhuǎn)錄［17-19］，有的則徹底失去功能成為假基因［16，20-24］。雖然在鯉基因組序列草圖數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對的過程中尚未發(fā)現(xiàn)45S rDNA旁系同源序列，但為了確保覆蓋可能存在的旁系同源序列，本研究中設(shè)計制備位于45S rDNA不同區(qū)域的多條探針分別用于FISH定位。

探針 CAAG1191長度為 116 bp，位于 5.8S rDNA上，是一段物種間高度保守的序列，其引物序列與人類5.8S rDNA(NR_003285.2)僅相差1個堿基，與斑馬魚 (CT583728.24)、巖原鯉(DQ994157.1)、四川白甲魚 (DQ994153.1)、重口裂腹魚 (DQ994148.1)等多種鯉科魚類的同源序列則完全相同，該探針可以用作鯉科魚類的通用探針。

探針CAAG1845長度為1 052 bp，位于18S rDNA上，序列相對保守，其引物序列與斑馬魚(BX296557.35)、銀鯽 (EF189737.1)兩個物種能夠通用。

探針CAAG3602長度為574 bp，位于非轉(zhuǎn)錄IGS區(qū)域，是一段保守程度較低的序列，在NCBI中進(jìn)行Blast比對，未在其他物種中檢索到同源序列。與另外兩條探針相比，探針CAAG3602為非轉(zhuǎn)錄序列，不會受到未被RNA酶降解的殘余核糖體RNA的干擾，因而能夠降低假陽性檢出率，顯微鏡下觀察時視野也較為潔凈，易于雜交信號的辨識。

3.2 45S rDNA的染色體定位

多數(shù)鯉科魚類的染色體二倍數(shù)為2n=50［13，25］，這是鯉科魚類的原始核型和進(jìn)化基點。而鯉具有100條染色體 (2n=100)，對其染色體數(shù)目和DNA含量的分析都顯示，鯉是鯉科魚類原始類群在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了全基因組復(fù)制事件而形成的四倍體物種［26-28］。David等［29］通過對鯉基因組非編碼區(qū)59個微衛(wèi)星位點的分析，證實其中有約60%的位點存在復(fù)制現(xiàn)象，并推測鯉為通過異種雜交實現(xiàn)基因組復(fù)制的異源四倍體，其基因組四倍化發(fā)生時間大約距今1 200萬年前。而對基因組編碼序列的研究表明，與同屬于鯉科的模式生物斑馬魚 (2n=50)相比，鯉大多數(shù)功能基因都存在比斑馬魚多一倍的旁系同源序列［27，29-33］，這些同源序列正是起源于基因組加倍過程中，來源于兩套染色體并行使同一功能的基因組序列。

本研究中3條位于45S rDNA序列不同區(qū)域的探針在兩品種鯉染色體上的定位結(jié)果均一致，僅能定位于一對同源染色體的唯一位點。作為生命活動不可或缺的重要基因，45S rDNA這一定位結(jié)果在功能基因分布整體且呈現(xiàn)四倍化特點的鯉基因組內(nèi)是非常顯著的特例，暗示著鯉基因組在經(jīng)歷了染色體整倍化復(fù)制事件后，又呈現(xiàn)出重新二倍化的現(xiàn)象。

圖2 DAPI染色后的散鱗鏡鯉和松浦鯉有絲分裂中期染色體顯微圖Fig.2 Chromosome images of mitotic metaphase in scattered mirror carp and Songpu carp，stained with DAPI

圖3 標(biāo)記探針的電泳圖Fig.3 Electrophoresis images of labeled probes

圖4 探針CAAG1191(A、B)和CAAG3602(C、D)分別在散鱗鏡鯉和松浦鯉染色體上的FISH定位Fig.4 FISH localization of probe CAAG1191(A，B)and CAAG3602(C，D)on chromosomes of scattered mirror carp and Songpu carp，respectively

圖5 探針CAAG1845(紅色)、CAAG1191(綠色)、CAAG3602(綠色)在散鱗鏡鯉和松浦鯉染色體上的FISH共定位Fig.5 FISH co-localization of probe CAAG1845(red)，CAAG1191(green)，and CAAG3602(green)on chromosomes of scattered mirror carp and Songpu carp

通過生物信息學(xué)比對，在鯉基因組序列草圖數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)45S rDNA旁系同源序列。在45S rDNA序列的不同位置上設(shè)計探針進(jìn)行FISH定位，各條探針的定位結(jié)果也均一致，表明45S rDNA位點的重新二倍化并不是由旁系同源序列的逐漸分化所帶來的，而更可能是因染色體水平的斷裂重排所導(dǎo)致。

3.3 45S rDNA作為染色體特異性標(biāo)識的意義

與其他物種相比較，鯉染色體呈現(xiàn)出數(shù)目眾多、形態(tài)較為微小的特征。以人類為例，基因組大小為3.0 Gb，具有46條染色體，有經(jīng)驗的觀察者在光學(xué)顯微鏡下即可逐一辨認(rèn)各條染色體，并判斷某些染色體異常及其與表型性狀的關(guān)系。而鯉基因組大小約為1.7 Gb［1］，分散成100條染色體，每條染色體長度都較短，同組的各條染色體之間差異更小，彼此之間很難憑借光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)特征進(jìn)行準(zhǔn)確分辨，這給以染色體遺傳規(guī)律為研究對象的細(xì)胞遺傳學(xué)研究帶來了很大困難。因此，尋找染色體特異性標(biāo)識探針在鯉細(xì)胞遺傳學(xué)研究中具有重要意義，它能夠使基因組序列與細(xì)胞學(xué)觀察聯(lián)系起來，實現(xiàn)染色體的準(zhǔn)確識別。

45S rDNA序列則符合這種需求，它在鯉基因組中僅定位于一對同源染色體上，可以用作該染色體的特異性標(biāo)識，并將其與已有遺傳連鎖圖譜中特定的連鎖群相對應(yīng)。孫效文等［2］報道了鯉的第一個遺傳連鎖圖譜，45S rDNA位于該圖譜1號連鎖群上，連鎖群長度為227 cM，包含15個標(biāo)記。本研究中所報道的3條探針均可用作1號連鎖群的特異性標(biāo)記，可應(yīng)用于鯉細(xì)胞遺傳學(xué)圖譜的構(gòu)建、鯉科魚類比較基因組學(xué)的分析以及染色體結(jié)構(gòu)變異與性狀關(guān)聯(lián)分析等的研究。

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