李洋，劉萍，李健，李吉濤，高保全

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023;2.中國水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071)

脊尾白蝦Exopalaemon carinicauda又名白蝦、小白蝦、五須蝦、青蝦、絨蝦、迎春蝦等，隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門Arthropoda、甲殼綱Curstacea、十足目Decapoda、游泳亞目Natantia、長臂蝦科Palaemonidae、長臂蝦屬Palaemon、白蝦亞屬Exopalaemon，系熱溫帶海區(qū)底棲蝦類，以黃渤海產(chǎn)量最高，是中國特有的3種經(jīng)濟(jì)蝦類之一，其產(chǎn)量僅次于中國對蝦Fenneropenaeus chinensis和中國毛蝦Acetes chinensis［1］。脊尾白蝦具有肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美、繁殖能力強(qiáng)、生長速度快、生長季節(jié)長和環(huán)境適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)。近年來，隨著沿海灘涂的開發(fā)，養(yǎng)殖面積迅速擴(kuò)大，已成為池塘單養(yǎng)、魚蝦貝類混養(yǎng)和蝦池秋冬季養(yǎng)殖的重要品種［2］。

目前，國內(nèi)對脊尾白蝦的研究主要集中在混養(yǎng)技術(shù)、急性毒性試驗(yàn)以及鹽度和中草藥等對其存活、生長的影響研究，王李寶等［3］對脊尾白蝦養(yǎng)殖過程中使用藥物劑量進(jìn)行了急性致毒試驗(yàn);曹梅等［4］研究了鹽度波動(dòng)和中草藥制劑對脊尾白蝦存活、生長和免疫的影響;張興國［5］對脊尾白蝦的混養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行了報(bào)道。但對于脊尾白蝦細(xì)胞遺傳學(xué)方面的研究尚未見報(bào)道。隨著脊尾白蝦產(chǎn)量和市場需求的日益增長，為了更好地進(jìn)行人工養(yǎng)殖、育種、選種等研究工作，對脊尾白蝦的種質(zhì)資源等基礎(chǔ)研究顯得極為迫切。王青等［6］先后對十足目甲殼動(dòng)物共計(jì)27科96種進(jìn)行了染色體數(shù)目的研究，其中對3科20種進(jìn)行了核型分析;姜葉琴等［7］對太湖秀麗白蝦Exopalaemon modestus進(jìn)行了染色體及核型的研究。本研究中，作者對同為白蝦屬的脊尾白蝦染色體進(jìn)行研究，旨在為脊尾白蝦的遺傳育種、人工養(yǎng)殖提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

于2010年7—8月從萊州灣捕撈野生脊尾白蝦活體，于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)24 h后，在解剖鏡下挑選親蝦抱卵已發(fā)育到原腸胚時(shí)期的受精卵，以備用。

1.2 方法

1.2.1 染色體的制備 將受精卵從親蝦游泳肢上剝離，放入用50%的海水 ［φ(海水) ∶φ(蒸餾水)=1∶1］配制的體積分?jǐn)?shù)為0.04%的秋水仙素中處理3 h，并用50%的海水沖洗干凈秋水仙素，使用0.075 mol/L的 KCl溶液低滲處理50 min，加入預(yù)冷到4℃的卡諾氏 (Carnoy)固定液［φ(甲醇)∶φ(冰乙酸)=3∶1)，15 min更換一次固定液，更換3次后置于4℃下保存。制片時(shí)使用50%的冰醋酸溶液進(jìn)行解離，用熱滴片法制片，用吉姆薩染液染色20 min，慢慢沖去染液，晾干后鏡檢。

1.2.2 染色體臂長的計(jì)算 染色體臂長的計(jì)算公式為

相對長度=(實(shí)測染色體長度/全部染色體長度總和)×100，

臂比=長臂長度/短臂長度。

2 結(jié)果

2.1 脊尾白蝦染色體數(shù)目的確定

對50尾雌蝦受精卵進(jìn)行滴片，從中挑選100個(gè)中期分裂相清晰的滴片進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，染色體條數(shù)在90時(shí)的出現(xiàn)頻率最高，達(dá)到81%，結(jié)果列于表1，由此確定脊尾白蝦染色體數(shù)目為2n=90。

表1 脊尾白蝦二倍體染色體數(shù)目的統(tǒng)計(jì)Tab.1 Chromosome counts in ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda

2.2 脊尾白蝦染色體的相對長度和臂比值分析

將所拍照片輸入計(jì)算機(jī)經(jīng)放大處理后利用投影儀描繪輪廓，并對清晰的中期分裂相染色體的長臂長、短臂長進(jìn)行測量與分析。脊尾白蝦染色體相對長度和臂比值列于表2。根據(jù)Levan等［8］提供的染色體核型分類依據(jù)，將脊尾白蝦染色體分為4類，其中中部著絲粒染色體 (m)共計(jì)56條，亞中部著絲粒染色體 (sm)共計(jì)8條，亞端部著絲粒染色體 (st)共計(jì)12條，端部著絲粒染色體(t)共計(jì)14條，故核型公式為2n=56m+8sm+12st+14t=90。圖1為依據(jù)染色體相對長度排列后的核型圖，圖2為染色體中期分裂相。

表2 脊尾白蝦染色體的相對長度、臂比及核型Tab.2 Relative length and arm ratio of metaphase chromosomes in ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda

3 討論

細(xì)胞遺傳學(xué)是研究細(xì)胞中染色體遺傳規(guī)律的學(xué)科，同時(shí)也是在細(xì)胞層次上進(jìn)行遺傳學(xué)研究的遺傳學(xué)分支學(xué)科，主要研究細(xì)胞中染色體的起源、組成、變化、行為和傳遞等機(jī)制及其生物學(xué)效應(yīng)。核型是細(xì)胞有絲分裂中期的全套染色體圖像按大小、形態(tài)成對排列的總和。染色體的核型分析是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的基本方法，是研究物種演化、分類以及染色體結(jié)構(gòu)、型態(tài)與功能之間的關(guān)系所不可缺少的重要手段。同時(shí)核型分析還是開展雜交育種、多倍體誘導(dǎo)等遺傳育種操作的基礎(chǔ)。對于脊尾白蝦人工養(yǎng)殖、育種、選種等研究工作也具有重要意義。

圖1 脊尾白蝦原腸胚染色體核型圖Fig.1 Karyotype of the ridgetail white prawn Exopalaemon cariniauda

圖2 脊尾白蝦染色體的中期分裂相Fig.2 Metaphase chromosomes of the ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda

在甲殼綱十足目動(dòng)物中因其染色體數(shù)目眾多，而且其有絲分裂中期染色體大多呈點(diǎn)狀，給核型分析帶來了很大的難度。李雅娟等［9］針對不同倍性泥鰍雜交后代的染色體數(shù)目采用低滲法進(jìn)行了研究并取得了較好的效果;劉萍等［10］和錢國英等［11］分別在中國對蝦和日本沼蝦Macrobrachium nipponense的染色體制備過程中就低滲法和管滲法進(jìn)行了比較分析，認(rèn)為整體上低滲法比管滲法效果要好;張?zhí)熹龋?2］和周麗青等［13］分別在羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergii和波紋唇魚Cheilinus undulatus的染色體制備過程中采用了研磨離心和熱滴片的方法進(jìn)行制片，在染色體數(shù)目眾多且不易分散的種類中采用熱滴片法進(jìn)行制片技術(shù)已經(jīng)非常成熟;Ojima等［14］首次提出低滲法制片以來經(jīng)過試驗(yàn)檢驗(yàn)制片效果非常完善。因此，本研究中在參考前人方法的基礎(chǔ)上通過實(shí)際操作，采用低滲法和熱滴片法獲得了脊尾白蝦原腸胚時(shí)期受精卵染色體的清晰分裂相，在操作過程中，為使染色體更好地分散開，可適當(dāng)提高滴片溫度和高度;為使染色體停滯在分裂中期，使用秋水仙素的處理時(shí)間和濃度要通過梯度試驗(yàn)來確定，通過低滲可以使細(xì)胞膨脹染色體間距拉大，經(jīng)過解離對獲得清晰分裂相有很大作用。

脊尾白蝦染色體數(shù)目為90條，與姜葉琴等［7］對同為白蝦屬的秀麗白蝦的染色體研究結(jié)果一致，根據(jù)Ahmed［15］提出的核型穩(wěn)定性觀點(diǎn)分析，脊尾白蝦具有較多的m型核型，由此認(rèn)為其具有較為穩(wěn)定的染色體組型。根據(jù)Murofuehi等［16］的十足類染色體倍數(shù)性進(jìn)化觀點(diǎn)，認(rèn)為染色體數(shù)目少的十足類核型則更為原始。根據(jù)邱高峰等［17-18］的研究表明，脊尾白蝦染色體數(shù)目與沼蝦屬和長臂蝦屬的染色體數(shù)目及核型組成方面相近。綜合比較后作者認(rèn)為，脊尾白蝦的進(jìn)化地位要比同為長臂蝦科的長臂蝦屬和沼蝦屬更為原始。

在已研究的十足目中只有鎧甲蝦科、方蟹科和異尾類中發(fā)現(xiàn)了性染色體［6］。Nakamura 等［19］也曾在十足目物種中發(fā)現(xiàn)了性染色體，而本研究中雖未發(fā)現(xiàn)性染色體，但也不能確定性染色體不存在，因?yàn)榧刮舶孜r染色體性狀多為點(diǎn)狀，而且數(shù)目龐大，制片過程中分散不均勻不清晰導(dǎo)致對其常染色體和性染色體的區(qū)分非常困難。因此，對脊尾白蝦性染色體還需采用其他方法進(jìn)行深入地研究，進(jìn)一步對其進(jìn)行補(bǔ)充與完善。

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