劉偉，曾真，戰(zhàn)培榮

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江哈爾濱150070;2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001)

懷頭鲇Silurus soldatovi隸屬于鲇科Siluridae、鲇屬Silurus，是黑龍江流域特產(chǎn)的大型肉食性魚類，目前已被列入易瀕危魚類。懷頭鲇棲息于較寬敞水體中，營底棲生活，多夜間捕食，冬季亦有攝食;自然水域中，主要捕食魚類，亦食水生昆蟲、蛙、鼠等活動物及其尸體，能吞食相當(dāng)于自身長度2/3的魚類;其胃容量大，消化能力極強(qiáng)，生長快。懷頭鲇具有很高的營養(yǎng)價值［1-2］，其胃還具有消腫補(bǔ)氣等藥用價值［3］。因此，探討其酶性質(zhì)與消化機(jī)能有重要意義。

有關(guān)魚類消化酶的研究主要集中在魚類食性、飼料、季節(jié)變化與消化酶的關(guān)系，酶促反應(yīng)與酶動力學(xué)，胚后發(fā)育階段消化酶的發(fā)生與演變，消化酶在體內(nèi)消化組織的分布等［4-9］。對太湖沿岸地區(qū)幾種常見肉食性魚類的胃蛋白酶和胰蛋白酶活性進(jìn)行比較研究表明，肉食性魚類 (特別是胃發(fā)達(dá)的)食物的消化主要在胃中，胃蛋白酶活性明顯高于腸蛋白酶［10］。懷頭鲇在攝食后3 h胃蛋白酶活性達(dá)到高峰，比腸蛋白酶活性高近1倍，并持續(xù)2～3 h［11］。Diaz等［12］用 SDS-PAGE 凝膠電泳研究了鯛科魚類幼體消化道中出現(xiàn)的蛋白酶類。而有關(guān)魚類消化酶的分離提純及應(yīng)用研究較少。

蛋白酶的分離提純研究始于20世紀(jì)50年代，對幾種常見的酶類如胃蛋白酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶等研究發(fā)現(xiàn)，各物種同源蛋白酶間存在不同程度的差異。1979年Becker等［13］用DEAE離子交換層析和親和層析先后提純了人胃蛋白酶Ⅰ、Ⅱ，并對其性質(zhì)作了研究。中國學(xué)者相繼用DEAF-52陰離子交換層析、高壓液相凝膠過濾層析從人胃黏膜中分離純化到相對分子質(zhì)量為67 000的胃蛋白酶原［14-15］;用底物親和法分離純化了蘄蛇胃蛋白酶［16］;用硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析、Phenythl-Sepharose疏水層析純化了嗜熱真菌熱穩(wěn)定蛋白酶［17］。近年來研究者以提高魚類消化酶的利用，或增加水產(chǎn)副產(chǎn)品為目的，對魚類蛋白酶研究逐步深入。張繼平等［18］提取了暗紋東方鲀的胃蛋白酶，黃麗洋等［19］提取了斑點叉尾鮰的腸蛋白酶，Ulitina等［20］從歐洲鲇Silirus glanis L.胃黏膜中分離出3種蛋白酶 (P1、P2和P3)。而對歐洲鲇的地理相近種——懷頭鲇胃蛋白酶的分離純化目前國內(nèi)外尚未見報道。本研究中，作者采用硫酸銨飽和梯度鹽析和Sephadex G-75凝膠過濾層析技術(shù)，初步建立了分離純化懷頭鲇胃黏膜蛋白酶的方法，旨在為進(jìn)一步探討懷頭鲇消化生理機(jī)能與食性的關(guān)系，以及魚類胃蛋白酶的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用懷頭鲇取自黑龍江水產(chǎn)研究所名優(yōu)魚類繁殖基地同批人工孵化魚苗，飼養(yǎng)于室內(nèi)控溫水族箱 (80 cm×60 cm×50 cm)，仔稚魚階段投喂水蚤、水蚯蚓等活餌料，幼魚至2齡階段投喂冰凍海泥鰍Plotosus liaeatus Thunberg，試驗時平均體質(zhì)量約800 g。水族箱設(shè)有水循環(huán)過濾裝置，以充分曝氣的地下水為水源，水溫為20～22℃。

1.2 方法

1.2.1 胃蛋白酶的粗提 (粗分級)

1)采樣時間。懷頭鲇胃黏膜蛋白酶活性在攝食后3 h達(dá)到高峰，故在喂食后3～4 h進(jìn)行采樣［5］。

2)酶原抽提。在冰盤上解剖懷頭鲇并剪下整個胃部，用蒸餾水清洗，再剪去胃外壁肌肉，保留內(nèi)壁黏膜組織。將黏膜組織剪碎，加入4倍質(zhì)量的雙蒸水，用高速勻漿器以10 000～13 000 r/min低溫勻漿2 h(每5 min間歇勻漿1 min)。若勻漿中有較多組織碎塊，應(yīng)盡可能剪碎黏膜組織。再將勻漿液以8 000 r/min冷凍離心15 min，上清即為胃蛋白酶原抽提液，蛋白酶活力為0.516 IU/mg。

3)酶原激活。用1 mol/L的鹽酸將胃蛋白酶原抽提液pH調(diào)至2.8，靜置2 h，酶原被激活為有活性的蛋白酶，即胃蛋白酶激活液，蛋白酶活力為61.95 IU/mg。將胃蛋白激活液用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4.2，并于4℃下保存。

4)鹽析與等電點沉淀。用硫酸銨進(jìn)行梯度分級鹽析。鹽析條件一:將胃蛋白酶激活液分裝在3只管中，加入4℃預(yù)冷的飽和硫酸銨溶液，分別至30%、50%和70%飽和度鹽析，靜置30 min，以8 000 r/min離心20 min，收集沉淀與上清。鹽析條件二:稱取1 g固體硫酸銨加入5 mL激活液中，靜置30 min，以8 000 r/min離心20 min，收集沉淀溶解于層析緩沖液;再重復(fù)上述 (鹽析條件二)步驟兩次，至硫酸銨飽和度分別為28%、56%和83%，收集沉淀和上清，鹽析沉淀分別用層析緩沖液溶解(鹽析液)。由于蛋白酶活性對溫度和pH敏感，操作均在低溫 (4℃)和低pH(pH 4.2)下進(jìn)行。

5)透析、濃縮。將胃蛋白酶鹽析液裝入透析袋內(nèi)，在低溫中用層析緩沖液進(jìn)行透析除鹽，并不斷更換緩沖液。再將透析袋浸入體積分?jǐn)?shù)為30%的蔗糖溶液中繼續(xù)透析，濃縮2 h，溶液體積縮小約三分之一，即獲得胃蛋白酶粗提液。

1.2.2 胃蛋白酶凝膠過濾層析 (細(xì)分級)

1)凝膠材料與樣品。選用瓊葡糖凝膠G-75 FF，制成凝膠懸浮液。將胃蛋白酶粗提液，加入灌裝好凝膠的層析柱內(nèi)進(jìn)行細(xì)分級提純。

2)層析條件的設(shè)定。由兩種規(guī)格的層析柱Φ1.6 cm×40 cm(A1)和Φ1.6 cm×60 cm(A2)，兩種層析緩沖液pH分別為3.3和4.2(B1、B2)，4種洗脫速度 0.3、0.6、0.8、1.0 mL/min(C1、C2、C3、 C4)， 組 合 成 A1B1C4、 A1B1C3、A1B2C2、A2B2C1、A2B2C3、A2B1C3 6種層析條件。

3)裝柱、上樣。裝柱時柱內(nèi)先注滿緩沖液，緩慢連續(xù)加入凝膠懸浮液，讓其自然沉降，使層析柱凝膠均勻，無裂縫，無氣泡產(chǎn)生。40 cm層析柱凝膠的高度為35 cm，60 cm層析柱凝膠的高度為52 cm。用緩沖液平衡層析柱至紫外檢測儀示數(shù)穩(wěn)定，待緩沖液流至與柱床表面相切時，加入樣品(上樣前樣品經(jīng)10 000 r/min離心5 min，以除去部分干擾層析的雜質(zhì))，用緩沖液輕輕沖洗層析柱內(nèi)壁，密封層析柱。40 cm柱的上樣量為1 mL，60 cm柱的上樣量為1.5 mL。

4)洗脫、收集。按設(shè)定洗脫速度和層析緩沖液進(jìn)行平衡和洗脫。緩沖液均用體積分?jǐn)?shù)為0.02%的疊氮鈉抑制微生物。紫外檢測儀靈敏度為2 A，采用自動或人工方法檢測蛋白質(zhì)濃度，分管收集各組合的層析峰蛋白2.5 mL。

1.2.3 鹽析和層析提純的檢測方法

1)用SDS-PAGE電泳檢測。制作凝膠時，將4.0 mL 30%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的丙烯酰胺、2.5 mL分離膠緩沖液 (2 mol/L Tris-HCl、10%SDS，pH 8.8)和3.5 mL雙蒸水混合后，加入10%APS溶液和TEMED原液配制12%的分離膠(分離的相對分子質(zhì)量為15 000～60 000)。取灌制分離膠3.5 mL，并加入雙蒸水使凝膠表面平整，約30 min完全凝固。將0.67 mL 30%丙烯酰胺、1.0 mL濃縮膠緩沖液 (pH 6.8)和2.3 mL雙蒸水混合后，加入10%APS溶液和TEMED原液灌制5%的濃縮膠，高度約為1 cm。在冰箱 (4℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

胃蛋白酶粗提液樣品上樣前以10 000 r/min離心5 min，取10 μL離心后的樣品加入2.5 μL樣品緩沖液，與蛋白Marker同時沸水浴5 min，即為電泳樣品。每孔上樣12.5 μL，未加樣品的孔加入12.5 μL緩沖液。在冰箱 (4℃)內(nèi)電泳73 min。

用體積分?jǐn)?shù)為0.1%的考馬斯亮藍(lán)染色10 min。加入脫色液，至底色澄清為止。

2)蛋白質(zhì)濃度的測定。蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)采用0.615 g/L BSA(牛血清白蛋白，-20℃冷凍保存)。將蛋白酶原抽提液、激活液、粗提液稀釋10～20倍后測試，層析峰蛋白液直接測試。將樣品混勻，用考馬斯亮藍(lán)顯色10 min，于595 nm處測定各管的吸光度。

蛋白質(zhì)濃度計算公式:

式中:P為蛋白質(zhì)濃度 (mg/mL)，A為測定管吸光度;A1為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度;A2為空白管吸光度;C為標(biāo)準(zhǔn)管蛋白質(zhì)濃度 (mg/mL)。

3)蛋白酶活力的測定 (Folin酚法)。將蛋白酶抽提液、激活液、粗提液稀釋2倍后的樣品和層析峰蛋白液均以3 000 r/min離心10 min，取上清進(jìn)行測試。樣品及試劑在測試前均平衡至室溫 (約25℃)。在37℃水浴中反應(yīng)20 min，于660 nm處測定各管的吸光度。以樣品空白作為對照。

根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.0098x(R2=0.9999)計算酶活力。

絕對酶活力定義:每毫升酶液在37℃下每分鐘分解蛋白生成1 μg酪氨酸為一個酶活力單位(U)。

相對酶活力 (比活力)定義:每毫克蛋白在37℃下每分鐘分解蛋白生成1 μg酪氨酸為一個酶活力單位 (U)，即為絕對酶活力與蛋白質(zhì)濃度的比值。

2 結(jié)果

2.1 胃蛋白酶粗提條件

2.1.1 鹽析方法一 胃蛋白酶激活液用30%、50%和70%飽和度硫酸銨梯度鹽析的上清和沉淀，經(jīng)SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖1所示，3個梯度的上清液 (圖1-A)及其沉淀 (圖1-B)中的蛋白組成均無明顯區(qū)別，沒有達(dá)到分級分離效果。在其沉淀的電泳圖譜中有預(yù)測的蛋白條帶 (圖1-B，箭頭所示)，相對分子質(zhì)量為31 000～43 000。

2.1.2 鹽析方法二 從圖2可見，用28%、56%和83%飽和度硫酸銨梯度分級鹽析獲得的沉淀和上清，即胃蛋白酶粗提液，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測其沉淀組分差異明顯，沉淀回收率高，得到較理想的分離效果。其中28%和56%飽和度鹽析沉淀電泳在蛋白相對分子質(zhì)量為26 000～47 000處條帶濃密，與圖1-B蛋白組成分布相近。飽和度為28%的沉淀中酶活力為69.59 IU/mg，約為56%飽和度中 (35.63 IU/mg)的兩倍，但飽和度為28%的沉淀中蛋白質(zhì)濃度 (1.995/2.611 mg/mL)較低;飽和度為83%的沉淀中酶比活力和蛋白質(zhì)濃度均很低，而上清中則幾乎沒有酶活力，電泳中亦無條帶顯示。

圖1 鹽析方法一的粗提液電泳結(jié)果Fig.1 The electrophoresis of the crude extract by the first salting out method

圖2 鹽析方法二的粗提液電泳結(jié)果Fig.2 The electrophoresis of the crude extract by the second salting out method

2.2 凝膠過濾層析條件的確定及提純效果

2.2.1 40 cm層析柱組合條件 從圖3可見:pH為3.3的緩沖液、1.0 mL/min洗脫速度條件下(A1B1C4)，層析峰在洗脫60 min時出現(xiàn)，收集層析峰測定蛋白酶活性為308.79 IU/mg，酶活力比鹽析粗提液提高5～9倍;pH為3.3的緩沖液、0.8 mL/min洗脫速度條件下 (A1B1C3)，層析峰在洗脫70 min時出現(xiàn);pH為4.2的緩沖液、0.6 mL/min洗脫速度條件下 (A1B2C2)，層析峰在洗脫110 min時出現(xiàn)。用40 cm層析柱，無論使用pH 3.3還是pH 4.2的緩沖液，流速從0.6 mL/min到1.0 mL/min，層析峰形均只有一個主峰。

圖3 3種層析條件下的洗脫層析圖 (1.6 cm×40 cm)Fig.3 The chromatographic peak in a chromatographic column(1.6 cm×40 cm)

2.2.2 60 cm層析柱組合條件 pH 4.2的緩沖液、0.3 mL/min洗脫速度條件下 (A2B2C1)，層析峰在洗脫400 min時出現(xiàn)一主峰，十幾個小峰(圖4)。

圖4 A2B2C1洗脫層析圖 (1.6 cm×60 cm)Fig.4 The components isolated by gel filtration chromatography in A2B2C1(1.6 cm×60 cm)

在0.8 mL/min流速下，分別用pH為3.3和4.2的緩沖液洗脫 (即A2B1C3和A2B2C3兩種層析條件)，均得到一個帶有鋸齒的主峰，層析峰分別出現(xiàn)在洗脫150 min和140 min時 (圖5、圖6)。分管收集A2B1C3組合的層析峰，共9管，測定各管的蛋白酶活力，結(jié)果如圖7所示，1號管和9號管 (a，b)層析峰液蛋白酶活力獲得兩個峰值，說明可能至少有兩種蛋白存在。

圖5 A2B1C3洗脫層析圖 (1.6 cm×60 cm)Fig.5 The components isolated by gel filtration chromatography in A2B1C3(1.6 cm×60 cm)

圖6 A2B2C3洗脫層析圖(1.6 cm×60 cm)Fig.6 The components isolated by gel filtration chromatography in A2B2C3(1.6 cm×60 cm)

圖7 層析峰分管收集液蛋白酶活力Fig.7 The activity of proteases from fraction liquid of chromatographic peak

3 討論

3.1 胃蛋白酶提純條件的選擇

在胃蛋白酶分離純化過程中，尤其是粗分級分離時，為得到濃度足夠高的粗提液需經(jīng)過反復(fù)試驗優(yōu)化粗提方法。如黏膜組織前處理、勻漿轉(zhuǎn)速、勻漿介質(zhì)、操作溫度等因素都會影響勻漿效果。提取酸性蛋白酶時勻漿介質(zhì)可用生理鹽水、檸檬酸緩沖液或蒸餾水［20-21］，本試驗中用4倍質(zhì)量的雙蒸水提取效果較好。實際應(yīng)用中，還需摸索一次處理大量樣品的最佳取樣時間、酶原激活時間以及可保持酶活力的合適緩沖液等。有真胃的生物胃蛋白酶原在胃酸 (H+)作用下 (pH＜5)，酶原自動激活，轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨人嵝缘?、有活性的胃蛋白酶。本試驗在pH為2.8、激活2 h條件下［16］獲得的激活液蛋白酶活力比勻漿抽提液提高120倍，激活效果明顯。有學(xué)者認(rèn)為，較高的硫酸銨飽和度有助于提高鹽析回收率，而較低的飽和度硫酸銨可保持較高比活力［17-18］。根據(jù)本試驗在28%、56%、83%飽和度分級鹽析檢測結(jié)果綜合分析，建議選擇40%～70%飽和度硫酸銨鹽析為宜［20］。但83%硫酸銨分級沉淀中有兩條很深的相對分子質(zhì)量約為47 000的蛋白條帶，是否為胃蛋白酶原，若適當(dāng)延長酶原激活時間，是否有可能激活更多酶原，有待試驗探討。

本試驗結(jié)果顯示，用Sephadex G-75 FF凝膠效果較好，層析峰出現(xiàn)明顯，純化后蛋白酶比活力顯著增加。凝膠過濾層析上樣量理論上為柱體積的1%～5%，經(jīng)本試驗驗證，60 cm層析柱最合適的上樣量為1.5%。通常以高柱長、低流速下凝膠過濾層析效果為佳，并要充分濃縮樣品，保證樣品濃度。本試驗在60 cm層析柱、pH為3.3的0.01 mol/L β-丙氨酸-甲酸緩沖液、0.8 mL/min洗脫速度條件下，層析分離效果較好，并在峰頂下落處出現(xiàn)帶鋸齒狀的峰形 (圖5)，推測若增加柱長(至75 cm)，同時減小流速 (至0.3 mL/min)，可以達(dá)到更高分辨率［22］。與歐洲鲇胃蛋白酶不同［20］，本試驗中在60 cm層析柱、pH為4.2的0.01 mol/L β-丙氨酸-乙酸緩沖液、0.3 mL/min洗脫速度條件下沒有達(dá)到預(yù)期效果 (圖4)。凝膠過濾層析只能根據(jù)表觀相對分子質(zhì)量分離蛋白，不能保證將所有的蛋白酶都分開，因為有可能存在表觀相對分子質(zhì)量很相近而組成卻不同的胃蛋白酶。若增加DEAE- 纖維素陰離子交換層析［13，18，20］，可以將有相同表觀相對分子質(zhì)量但所帶電荷不同的蛋白酶分離，提純效果會更好。有待進(jìn)一步分離試驗并確定其組分和性質(zhì)。

3.2 魚類蛋白酶的應(yīng)用

蛋白酶在許多領(lǐng)域有廣泛的用途。如蛋白水解酶在食品工業(yè)中用于肉的軟化及生產(chǎn)氨基酸制品［16-17］;醫(yī)學(xué)上用于酶診斷和酶治療 (尤其是在外科手術(shù)中)［15］;農(nóng)業(yè)上用于飼料蛋白酶添加劑和生物肥中，以增加效率［18，23］。此外，蛋白水解酶作為工具酶廣泛用于蛋白質(zhì)和多肽的一級結(jié)構(gòu)、酶活性位點等研究，以及解決其它酶學(xué)和分子生物學(xué)等重要問題［11，22］。因此，尋找高活性蛋白酶的新來源仍十分重要而迫切。

由于胃黏膜蛋白酶組成較復(fù)雜，本試驗中只對懷頭鲇胃黏膜蛋白酶進(jìn)行了初步純化。試驗用SDS-PAGE檢測的懷頭鲇胃黏膜蛋白酶相對分子質(zhì)量為26 000～47 000，根據(jù)電泳圖譜、層析圖和層析峰酶活力測定結(jié)果推測，可能至少有兩種胃蛋白酶存在。Ulitina等［20］對歐洲鲇胃黏膜蛋白酶用凝膠過濾層析和離子交換層析分離出兩種相對分子質(zhì)量(30 200、39 800)的3種蛋白酶。懷頭鲇胃蛋白酶相對分子質(zhì)量范圍與歐洲鲇相近，二者與胃蛋白酶Ⅰ、Ⅱ的相對分子質(zhì)量亦相近［14-15］，說明懷頭鲇極強(qiáng)的消化能力是在長期進(jìn)化與自然適應(yīng)中獲得的生化遺傳性狀，消化機(jī)能相對較完善，對魚類消化酶在系統(tǒng)進(jìn)化方面的研究具有重要價值。不同魚類的消化道構(gòu)造，消化酶種類、特性及活性分布均有不同。消化酶的特征可反映魚類的消化能力及種的屬性，魚類消化酶學(xué)研究將成為水產(chǎn)養(yǎng)殖及分子育種中的基礎(chǔ)工作。

提純胃蛋白酶可以從酶本身的結(jié)構(gòu)性質(zhì)來探討魚類消化酶的穩(wěn)定性和動力學(xué)問題。葉元土等［24］、王立波等［25］分別研究了南方鲇S.meridionalis和懷頭鲇兩種同屬魚的胃蛋白酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶最適pH值為2.6，均低于胃腔內(nèi)的pH值，而最適溫度分別為33℃和35℃，均高于其生活水體環(huán)境溫度。本試驗中對懷頭鲇胃蛋白酶分離純化組分的活性檢測結(jié)果說明，可以在離體條件下對酶活性質(zhì)進(jìn)行深入研究。消化酶分析研究為揭示和評定魚類早期發(fā)育健康狀況、食性、添加外源酶效果和自然水域餌料基礎(chǔ)等情況可提供生理生化依據(jù)［10］，如Diaz等［12］通過研究評價鯛科魚類幼體消化道蛋白酶類，確定了其幼體對外源酶的依賴性，從而進(jìn)一步了解酶類與食物的相互作用及酶的適應(yīng)性。消化酶研究還可從消化生理和酶學(xué)角度解釋或解決魚類生長和食物轉(zhuǎn)換利用等問題，在減少魚類氮、磷的排泄量，處理氮、磷超標(biāo)排放水體，保護(hù)生態(tài)環(huán)境等方面亦有重要意義。

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