趙 欣，李 巖，王 麗 爽，張 宗 申

（大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034）

0 引言

金鐵鎖（Psammosilenetunicoides）隸屬石竹科金鐵鎖屬，生長周期長、自然繁殖能力差，集中分布在高海拔、溫差小的云南、貴州等西南部地區(qū)，是我國特有的單種屬植物和傳統(tǒng)的民族藥用植物［1-2］。藥用植物中很多藥用成分都是次生代謝產(chǎn)物，而次生代謝與細胞生長和發(fā)育階段、基因型和外界環(huán)境因素等都有很大關系。研究發(fā)現(xiàn)，分布于細胞膜上的各種離子通道參與細胞信號傳導、生長等過程中，對細胞系列生理生化代謝具有重要影響［3］。目前，關于離子通道與藥用成分次生代謝之間關系的研究報告很少。

本實驗利用傳統(tǒng)酶解法［4］和快速酶解法［5］制備金鐵鎖原生質體，并利用全細胞電流記錄手段比較了兩種方法獲得的原生質體的質量，為后續(xù)探討藥用植物與其他植物在細胞膜離子通道上是否存在差異提供合適的研究材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金鐵鎖愈傷組織繼代周期和培養(yǎng)條件按照參考文獻［1］進行，培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L。

纖維素酶（Cellulase）R-10，購于上海三杰生物技術有限公司；纖維素酶RS，購于Yakult Honsha（Japan）；果膠酶（Pectolyase）Y-23，購于Seishin Pharmaceutical（Japan）。

1.2 方 法

1.2.1 傳統(tǒng)酶解法

1.2.1.1 金鐵鎖愈傷組織原生質體的分離

參考劉強［4］、王麗爽［6］等的方法并略作修改。取繼代13d 的愈傷組織1g，將其放入1 mL CPW-13M（101 mg/L KNO3，27 mg/L KH2PO4，246mg/L MgSO4·7H2O，1 480mg/L CaCl2·2H2O，13%甘露醇）溶液中暗孵育1h。加入10mL酶液（不同濃度組合的酶溶于CPW-8M 溶液中，pH 5.8），在24 ℃、60r/min的搖床上黑暗振蕩酶解。

1.2.1.2 原生質的純化［7］

酶液經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾，800r/min 離心5min，棄上清液，重復3次，收集原生質體。原生質體懸浮于CPW-8M（101mg/L KNO3，27mg/L KH2PO4，246mg/L MgSO4·7H2O，1 480mg/L CaCl2·2H2O，8%甘露醇）洗滌液中，800r/min離心5min，棄上清液，重復3次。

1.2.2 快速酶解法

參照Pandey［5］的方法略作修改。取繼代13d的愈傷組織0.5g，加入1mL 酶液（0.1mmol/L KCl，0.1mmol/L CaCl2，10mmol/L Asc，0.5%BSA，1.2%纖維素酶RS，0.5% Pectolase Y-23，滲透壓用山梨醇調節(jié)至400 mmol/kg，pH 5.5）在22 ℃，45r/min的搖床上黑暗震蕩反應15min，加入300μL 的基本介質（10mmol/L 谷氨酸鉀，10 mmol/L Mes，1 mmol/L CaCl2，4mmol/L MgCl2，滲透壓用山梨醇調節(jié)至400mmol/kg，pH 5.8）再反應5min后出現(xiàn)個別脫落的原生質體，加入等體積基本介質5min后，過雙層濾網(wǎng)，然后450r/min預離心4min，去掉最上部2 mL 和最下部1 mL，取中間部分700r/min離心10min，保留最下面1mL，重復2次，收集原生質體。

1.2.3 金鐵鎖原生質體內向K+電流的測定

將0.5mL原生質體懸浮液加入到4.5 mL基本介質中，靜置10 min，在倒置顯微鏡下選取胞質清晰、膜完整性良好的原生質體，移動含有電極液（80 mmol/L 谷氨酸鉀，20 mmol/L KCl，10mmol/L Hepes，5 mmol/L ATP-Mg，滲透壓用山梨醇調節(jié)至500 mmol/kg，pH 7.2）的玻璃微電極，添加適當負壓，進行封接。刺激電壓從-190mV逐漸去極化到+100 mV，每級為+20mV，維持時間3s，頻率為0.2 Hz，全細胞封接形成10 min 后采集數(shù)據(jù).使用Pulse+Pulsefit軟件采集和分析全細胞電流［7］。

2 結果與討論

2.1 傳統(tǒng)酶解法制備金鐵鎖原生質體

2.1.1 酶液濃度組合對分離原生質體的影響

在不同濃度組合的酶液處理下，相同酶解時間，原生質體產(chǎn)率明顯不同。由表1可見，原生質體的產(chǎn)率隨著酶濃度的升高而有顯著提升，在2%纖維素酶R-10+1%果膠酶Y-23組合下產(chǎn)率最高。當濃度繼續(xù)提高時，原生質體的產(chǎn)率反而下降。每種植物細胞壁中纖維素和果膠的含量都不相同，需要選擇最適的酶液組合濃度使原生質體的產(chǎn)率達到最高，但過高的酶液濃度反而會對制得的原生質體產(chǎn)生損傷，使其質膜迅速破裂、細胞內容物釋放出來。

2.1.2 酶解時間對分離原生質體的影響

每隔1h，觀察一次原生質體的酶解情況。酶解2h后就出現(xiàn)了少量的原生質體，隨著酶解時間的延長，原生質體的數(shù)量不斷增加，在7h時產(chǎn)率達到最高。隨著時間的繼續(xù)延長，原生質體數(shù)量開始減少，碎片不斷增多，說明已經(jīng)產(chǎn)生的原生質體破裂，整體瓦解了（見圖1）。

表1 酶液濃度組合對原生質體分離的影響Tab.1 Effect s of enzyme concentration on separation of protoplasts

圖1 酶解時間對原生質體分離的影響Fig.1 Effects of zymohydrolysis time on protoplast isolation

2.2 快速酶解法制備金鐵鎖原生質體

2.2.1 酶解時間對分離原生質體的影響

將酶液進行一定程度的稀釋，可以精確控制酶解時間，即使酶解時間稍長，也會由于其濃度較低，使得對細胞膜的損傷較小。但如果將酶液濃度稀釋很低，雖然可以更好地掌握酶解時間，但是由于時間過長，容易產(chǎn)生特別微小的細胞碎片和滋生微生物，將玻璃微電極的前端堵塞。如果不將酶液稀釋，25min即產(chǎn)生大量的原生質體和碎片，在離心過程中高效的酶液依然發(fā)揮作用，一段時間后產(chǎn)生的原生質體大部分發(fā)生破裂。在酶液反應15min后，加入300μL 的基本介質將其稀釋，繼續(xù)反應5min后，大的細胞團開始脫落，繼續(xù)加入1mL 基本介質將酶液進一步稀釋，反應5min后，少數(shù)細胞變圓成為原生質體，但大部分的細胞仍有殘余的細胞壁。在離心過程中殘余的酶液會繼續(xù)酶解部分細胞的細胞壁，雖然最終獲得的原生質體數(shù)量較少，但由于酶解時間短，使細胞膜受到的損傷較小，完整性良好。

2.2.2 滲透壓對分離原生質體的影響

將產(chǎn)生的原生質體放于300、350、400、450、500mmol/kg的基本介質中，4 ℃冰箱中過夜觀察，結果見表2。由表2可知，4℃冰箱中過夜后，400mmol/kg下原生體保存的數(shù)量最多，且胞質飽滿，細胞膜厚實圓滑。

表2 滲透壓對原生質體分離的影響Tab.2 Effect of osmotic pressure on protoplasts isolation

2.3 不同酶解法下獲得的原生質體對膜片鉗實驗的影響

傳統(tǒng)酶解法雖然產(chǎn)生的原生質體較多，但因為細胞膜與酶液接觸時間較長受到了不同程度的損害，使得制得的原生質體無彈性、易破碎，不適宜用于后續(xù)實驗；并且因為酶解時間較長，分離純化不夠徹底，原生質體懸浮液中存在大量細小細胞碎片和滋生微生物，極易將玻璃微電極的前端堵塞。而快速酶解法獲得的原生質體雖然數(shù)量較少，但與酶液直接接觸的時間短，細胞膜受到的損傷很小，制得的原生質體完整、彈性好，靜置1h左右就可以用于膜片鉗實驗，原生質體懸浮液中滋生微生物的可能性較小。綜合考慮，快速酶解法制得的原生質體更適合作為膜片鉗實驗的材料。

2.4 金鐵鎖細胞原生質體的鉀電流特征

靜息電位是指細胞在未受刺激條件的非興奮狀態(tài)下的膜電位，在此情況下細胞膜主要處于鉀離子平衡電位水平，靜息電位主要由內向整流性鉀離子通道參與形成的。在實驗條件下，金鐵鎖細胞的靜息電位在-52mV 左右，內向K+電流在100～350 pA，比擬南芥這一模式植物高100pA 左右，電流強度隨刺激電壓的變化而穩(wěn)定平滑（圖2），所以，快速酶解法制得的原生質體更適合作為膜片鉗實驗的材料測定細胞全電流。

3 結論

本文以金鐵鎖愈傷組織為材料，研究了兩種不同酶解法制得原生質體的條件，并分析比較了兩種不同酶解方法下制得的原生質體。

（1）利用傳統(tǒng)酶解法制備金鐵鎖原生質體，產(chǎn)率隨著酶濃度的變化先升高后降低，在2% 纖維素酶R-10+1% 果膠酶Y-23 下產(chǎn)率最高；原生質體的數(shù)量隨著酶解時間的延長也是先增加后減少，在7h時產(chǎn)率最高。

圖2 金鐵鎖原生質體全細胞質膜電流特征Fig.2 Characteristic of the whole-cell currents of P.tunicoides protoplasts

（2）快速酶解法制備原生質體，酶解時間短，相對于長時間處理，細胞膜受到的損傷小，完整性更好；4 ℃冰箱過夜、400mmol/kg滲透壓下的原生體保存的數(shù)量最多，且胞質飽滿，細胞膜厚實圓滑，同時認為快速酶解法制得的原生質體是進行金鐵鎖細胞膜片鉗實驗的良好材料，為后續(xù)的工作奠定了基礎。