曹 倩 倩，朱 蓓 薇，楊 靜 峰，宋 葉 涵，張 元 峰

（1.大連工業(yè)大學 海洋食品教育部工程研究中心，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)貝類專業(yè)分中心，遼寧 大連 116034）

0 引言

硫酸酯多糖是一類糖羥基上帶有硫酸根的多糖，與非硫酸酯多糖相比具有多方面的生物活性。硫酸酯化多糖除已證實具有抗凝血作用外，近年來不斷發(fā)現(xiàn)還具有其他多種生物活性，如增強免疫功能、抗腫瘤、抗病毒等，因此，硫酸酯化多糖的研究也受到了極大的關注［1-2］。目前，各種植物多糖如香菇多糖、黃芪多糖、淫羊藿多糖等的硫酸化修飾的研究已經(jīng)取得了一定的進展，對其硫酸化方法、硫酸酯的結(jié)構(gòu)以及活性都進行了較深入的研究［3-5］。

然而，對動物多糖的硫酸化修飾方面的研究卻未見報道。另外，目前的研究大都以結(jié)構(gòu)復雜的多糖作為修飾物，在其構(gòu)效關系方面的研究影響因素較多，不易闡明。因此，本文以扇貝糖原（scallop muscle glycogen，SMG）為研究對象，建立貝類動物糖原的硫酸化方法，糖原所具有的單純結(jié)構(gòu)為研究硫酸化修飾對多糖的多方面影響提供了有利的基礎，也為貝類糖原的開發(fā)利用提供思路。通過對扇貝糖原硫酸化修飾條件的優(yōu)化，以期得到最佳工藝條件，為研究其活性及其構(gòu)效關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

新鮮蝦夷扇貝，購于大連市春柳市場；胃蛋白酶，分析純，上海生工生物工程有限公司；明膠，優(yōu)級純，上海生工生物工程有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

Agilent 6890N 型氣相色譜儀，Agilent公司；傅里葉變換紅外光譜儀SPECTRUM ONE-B，Perkin Elmer公司；T6紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；LG-1.0真空冷凍干燥機，沈陽航天新陽速凍設備制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 扇貝糖原的制備

將新鮮的蝦夷扇貝取貝柱洗凈，冷凍干燥，粉碎。用胃蛋白酶酶解樣品提取糖原，酶解條件為：料液比1∶30（g/mL），加酶量為底物質(zhì)量的2.0%，pH 2.0，溫度37 ℃，酶解時間為2h。酶解液經(jīng)4 000r/min離心10min，取上清液加入3倍體積95% 乙醇，醇沉過夜。醇沉液離心（4 000r/min，10min）后，收集沉淀，加少量去離子水使其復溶、離心，上清液凍干得扇貝粗糖原。

采用木瓜蛋白酶結(jié)合Sevag法除蛋白，直到無游離蛋白出現(xiàn)為止，收集上清液。裝入截留分子質(zhì)量為7ku透析袋內(nèi)，流動水透析24h，去離子水透析24h。反復凍融至離心無沉淀出現(xiàn)，冷凍干燥后得扇貝糖原，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 扇貝糖原的單糖組成分析

依照文獻［6］的方法對扇貝糖原進行水解和乙?；?，使用氣相色譜進行單糖組成分析。

1.3.3 扇貝糖原的紅外光譜分析

以m（樣品）∶m（KBr）=1∶100的比例混合研細后，以KBr為本底，在4 000～400cm-1掃描紅外吸收。

1.3.4 糖含量及硫酸根含量檢測

糖含量檢測：采用苯酚-硫酸法［7］進行檢測。

硫酸根含量檢測：采用氯化鋇-明膠法［8］進行檢測。硫酸取代度公式為

1.3.5 扇貝糖原的硫酸酯化方法

扇貝糖原的硫酸酯化采用氯磺酸-吡啶法［5］。將25mL無水吡啶加入三頸燒瓶置冰鹽浴中，按設定的氯磺酸-吡啶體積比邊攪拌邊逐滴加入氯磺酸，于40 min 內(nèi)加完。稱取一定量的扇貝糖原，溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺中，充分攪勻后，加入裝有酯化試劑的三頸燒瓶中，按設定的水浴溫度和反應時間攪拌反應。反應結(jié)束后中和至pH 7.0，醇沉，離心取沉淀。復溶于水，透析，冷凍干燥得扇貝糖原硫酸酯（sulfated scallop muscle glycogen，SSMG）。

1.3.6 酯化試劑對扇貝糖原硫酸化修飾的影響

稱取200mg樣品，按照“1.3.5”的方法，調(diào)節(jié)氯磺酸與吡啶的體積比為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8，將反應溫度和反應時間分別固定在60 ℃和2h，測定DS和糖含量。

1.3.7 反應溫度對扇貝糖原硫酸化修飾的影響

稱取200mg樣品，按照“1.3.5”的方法，調(diào)節(jié)反應溫度為50、60、70、80、90℃，將氯磺酸與吡啶的體積比固定為1∶5，反應時間固定為2h，測定DS和糖含量。

1.3.8 反應時間對扇貝糖原硫酸化修飾的影響

稱取200mg樣品，按照“1.3.5”的方法，調(diào)節(jié)反應時間為1、2、3、4、5h，將氯磺酸與吡啶的體積比固定為1∶5，反應溫度固定為70 ℃，測定DS和糖含量。

1.3.9 扇貝糖原硫酸化修飾條件的確定

在單因素試驗的基礎上，選出最佳試驗條件，采用正交試驗法確定扇貝糖原硫酸酯化的工藝條件。稱取500mg 樣品，按照氯磺酸與吡啶的體積比、反應溫度和反應時間作三因素三水平L9（33）正交試驗，結(jié)果見表1。

表1 正交試驗因素水平表Tab.1 The factors and levels of orthogonal experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 扇貝糖原的提取及單糖組成

扇貝貝柱干粉經(jīng)過胃蛋白酶提取及除蛋白步驟，扇貝糖原的得率為13.78%，其中糖質(zhì)量分數(shù)為91.62%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)僅為1.4%。

扇貝糖原經(jīng)酸水解后，其乙酰化衍生物的氣相色譜分析結(jié)果見圖1。圖1 中只出現(xiàn)兩個峰，與標準單糖的保留時間相比，除內(nèi)標肌醇外，其中只含葡萄糖。由此可知其基本組成僅為葡萄糖，為典型的糖原單糖組成特征。

圖1 扇貝糖原單糖組成的氣相色譜圖Fig.1 GC analysis of monosaccharide composition of SMG

2.2 扇貝糖原及其硫酸酯的紅外光譜分析

對比扇貝糖原和扇貝糖原硫酸酯的紅外光譜可知（圖2），兩者均表現(xiàn)出一些糖的特征性吸收峰：在3 444cm-1附近有一強且寬的吸收峰，表明有糖上的O—H 鍵伸縮振動；1 022cm-1附近有強吸收，表示有糖上的O—H 鍵變角振動。所不同之處在于糖原經(jīng)過硫酸酯化修飾后SSMG 在1 228cm-1出現(xiàn)一個強的吸收峰，為 S==O 伸縮振動的特征吸收峰；在800～1 000cm-1附近有一組C—O—S伸縮振動吸收峰［7］。紅外光譜分析表明扇貝糖原經(jīng)過硫酸酯化修飾后其糖基已經(jīng)被硫酸基所修飾表現(xiàn)出特有的硫酸基修飾信號峰。

圖2 扇貝糖原及其硫酸酯的紅外光譜圖Fig.2 IR spectrum of SMG and SSMG

2.3 扇貝糖原硫酸酯化反應單因素的確定

2.3.1 酯化試劑對扇貝糖原硫酸化修飾的影響

由表2可以看出，當反應溫度和反應時間確定的情況下，DS的大小隨著氯磺酸與吡啶的體積比的增大有起伏變化，在體積比為1∶5時，DS最高；糖質(zhì)量分數(shù)隨著氯磺酸與吡啶的體積比的增大變化不是很大。主要是因為氯磺酸屬于強酸性物質(zhì)，隨著體積比的增加對糖原糖鏈的降解作用增強。

表2 酯化試劑比例對硫酸化修飾的影響Tab.2 Effects of reagent proportion on the sulfating modification

2.3.2 反應溫度對扇貝糖原硫酸化修飾的影響

由表3可以看出，當酯化試劑體積比和反應時間確定的情況下，DS的大小隨著反應溫度的升高起伏較大，在70 ℃時DS最大。糖質(zhì)量分數(shù)隨著反應溫度的增加，有所減小但相差不大。因為扇貝糖原在高溫的酸性環(huán)境下容易降解，硫酸化程度高。

表3 反應溫度對硫酸化修飾的影響Tab.3 Effects of reaction temperature on the sulfating modification

2.3.3 反應時間對扇貝糖原硫酸化修飾的影響

由表4可以看出，當酯化試劑體積比和反應溫度確定的情況下，DS的大小隨著反應時間的增加呈現(xiàn)明顯的先增大后減小的趨勢，在反應時間為3h時DS出現(xiàn)峰值為1.81；糖質(zhì)量分數(shù)隨著時間的增大，變化趨勢不是很明顯。可見反應時間對糖分解的影響不是很大。主要是隨著反應時間的增加，酯化試劑與糖原的反應越完全，取代度越大。

2.4 扇貝糖原硫酸酯化工藝條件優(yōu)化結(jié)果與分析

以單因素試驗結(jié)果為依據(jù)進行三因素三水平的正交試驗（表1）。正交試驗所得的硫酸根取代度與糖質(zhì)量分數(shù)結(jié)果及其極差分析（表5）。

表4 反應時間對硫酸化修飾的影響Tab.4 Effects of reaction time on the sulfating modification

從表5的極差分析可以看出，對于以取代度為指標來說，因素影響程度大小為B＞A＞C，反應溫度因素的極差最大為0.63，即說明反應溫度對硫酸化試驗的影響最大，氯磺酸與吡啶的體積比次之為0.62，反應時間的影響最小為0.56。各因素的取代度極差分析表明，氯磺酸與吡啶的體積比的取代度極差最大為k2（1.59），反應溫度的取代度極差最大為k1（1.64），反應時間的取代度極差最大為k2（1.61），所以扇貝糖原硫酸化反應條件的最佳組合為A2B1C2，即最佳試驗條件為氯磺酸與吡啶的體積比為1∶5，反應溫度為60 ℃，反應時間為3h。

表5 硫酸酯化工藝條件優(yōu)化結(jié)果Tab.5 The result of optimization sulfated factor

3 結(jié)論

（1）采用胃蛋白酶提取扇貝糖原，其得率為13.78%，其中糖質(zhì)量分數(shù)為91.62%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為1.4%。

（2）紅外光譜分析表明，硫酸基與扇貝糖原形成硫酸酯化合物，采取氯磺酸-吡啶法對扇貝糖原進行硫酸化效果較好。

（3）扇貝糖原硫酸化修飾的最佳條件為：氯磺酸與吡啶的體積比為1∶5，反應溫度為60 ℃，反應時間為3h。