閆冰，宋新剛，李尊江

（哈藥集團生物疫苗有限公司， 黑龍江哈爾濱 150069）

無菌塑料瓶無菌檢驗方法的驗證

閆冰，宋新剛，李尊江

（哈藥集團生物疫苗有限公司， 黑龍江哈爾濱 150069）

無菌塑料瓶是獸用滅活疫苗的主要內(nèi)包裝材料，滅活疫苗為非最終滅菌的產(chǎn)品，所以要求用于內(nèi)包裝材料的塑料瓶在使用前達到無菌。對無菌塑料瓶進行無菌檢驗，是保證產(chǎn)品質(zhì)量的必要的條件。《中國獸藥典》2005年版要求在對制品進行“無菌檢驗”及“微生物限度檢驗”時，應(yīng)進行方法學(xué)驗證，以確認(rèn)試驗中供試品應(yīng)選擇藥典中所收載的何種供試液制備方法、保種測定方法，保證“無菌檢查”或“微生物限度檢查”方法的科學(xué)性和檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

一、樣品與儀器

1.樣品。無菌塑料瓶，規(guī)格為100 ml/瓶，生產(chǎn)批號為091134。

2.試驗用菌種。金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、銅綠假單胞菌（ATCC9027）、生孢梭菌（ATCC11437）、白色念珠菌（ATCC10231）、黑曲菌（ATCC16404）。所有菌株均來自中國獸藥監(jiān)察所。

3.稀釋液。0.9%氯化鈉溶液，經(jīng)121℃30分鐘高壓滅菌。

4.培養(yǎng)基。硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基（50 ml/瓶）、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（50 ml/瓶），均為本公司自制，經(jīng)無菌檢驗及培養(yǎng)基靈敏度試驗合格。

5.儀器設(shè)備。薄膜過濾器6套，振蕩儀、生化培養(yǎng)箱。

二、方法與結(jié)果

1.方法。

（1）取樣量：每個過濾器取三支塑料瓶，分別加入標(biāo)示量1/2的氯化鈉無菌水溶液。

（2）每個過濾器取三支塑料瓶，分別加入標(biāo)示量1/2的氯化鈉無菌水溶液，輕輕振搖涮洗內(nèi)壁，按薄膜過濾法過濾，取出濾膜分成兩份，分別接種于硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，作為供試管。

（3）取3支無菌塑料瓶，分別加入50 ml的氯化鈉溶液，輕輕振搖涮洗內(nèi)壁，按薄膜過濾法過濾，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的金黃色葡萄球菌，過濾。取出濾膜，加入硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；作為試驗管1。

（4）按上法操作，按薄膜過濾法過濾，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的銅綠假單胞菌，過濾。取出濾膜，加入硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；作為試驗管2。

（5）按上法操作，按薄膜過濾法過濾，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的生孢梭菌，過濾。取出濾膜，加入硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；作為試驗管3。

（6）按上法操作，按薄膜過濾法過濾，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的白色念珠菌，過濾。取出濾膜，加入葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)；作為試驗管4。

（7）按上法操作，按薄膜過濾法過濾，在最后一瓶塑料瓶涮洗液中加入小于100CFU的黑曲菌，過濾。取出濾膜，加入葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)；作為試驗管5。

（8）取硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基3瓶和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基2瓶，分別加入以上小于100CFU的試驗菌，培養(yǎng)，作為陽性對照管。

（9）取硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基和葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基各一瓶，作為陰性對照。

（10）以上各試驗瓶均按規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，觀察試驗菌的生長情況。

2.方法驗證試驗結(jié)果 （見表1）。試驗管5管中的各試驗菌均生長良好，顯示塑料瓶采取的滅菌方法對無菌檢查結(jié)果的判斷沒有影響，供試管各管在規(guī)定溫度培養(yǎng)14 d逐日觀察，供試品管均澄清，陽性對照管生長良好，判供試品符合規(guī)定。塑料瓶為產(chǎn)品內(nèi)包材，本身無抑菌作用，通過方法確認(rèn)塑料的滅菌方法對無菌檢驗結(jié)果的判斷沒有影響，故按實驗方法建立的方法驗試驗，可作為無菌塑料瓶的無菌檢查，但陽性試驗菌只選擇金葡萄球菌即可。

表1 方法驗證試驗結(jié)果

三、討論

無菌塑料瓶在獸藥生產(chǎn)領(lǐng)域使用非常廣泛，建立無菌塑料瓶的無菌檢驗方法，是獸藥產(chǎn)品質(zhì)量的前提保證。薄膜過濾法作為無菌檢查中的一種方法，具有準(zhǔn)確、方便、快捷的優(yōu)點，是無菌檢查時所采用的一種重要方法，尤其對樣品液體量較大的樣本，更有其優(yōu)越性，所以該無菌檢查方法驗證對保證結(jié)果的可信度和準(zhǔn)確性具有重要意義。

（略）