張姍姍 薛玉英 唐 萌 張 婷 劉曉閏 張 鵬 張智勇

(1東南大學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009)

(2東南大學(xué)江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009)

(3東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 210009)

(4中國科學(xué)院高能物理研究所，北京 100049)

納米銀在小鼠體內(nèi)的組織分布

張姍姍1，2，3薛玉英1，2，3唐 萌1，2，3張 婷1，2，3劉曉閏1，2，3張 鵬4張智勇4

(1東南大學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009)

(2東南大學(xué)江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009)

(3東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，南京 210009)

(4中國科學(xué)院高能物理研究所，北京 100049)

將分散在生理鹽水中的納米銀以尾靜脈注射的方式注入小鼠體內(nèi)，采用電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS)法檢測其在小鼠體內(nèi)的組織分布情況，并利用DAS藥物動力學(xué)軟件分析其在血液中的動力學(xué)參數(shù).實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:納米銀經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)后，血液中的w(Ag)在染毒1 h內(nèi)呈快速下降趨勢，其后的24 h內(nèi)w(Ag)處于平穩(wěn)狀態(tài);納米銀在體內(nèi)的消除半衰期為22.8 h，分布容積為26.8 L/kg;進(jìn)入體內(nèi)的納米銀可隨血液循環(huán)快速分布到全身各臟器，6 h后即可在小鼠的多個主要臟器中檢測到銀的存在，其中脾臟中的w(Ag)約為203 μg/g;滯留在體內(nèi)的銀主要分布在肝臟和脾臟中.由此可見，納米銀具有較高的組織親和力，肝臟和脾臟可能是納米銀的主要蓄積作用靶器官.

納米銀;尾靜脈注射;組織分布

銀是一種應(yīng)用歷史悠久的貴金屬，具有良好的殺菌能力.利用現(xiàn)代納米技術(shù)將銀納米化后，銀顯示出非同尋常的理化特性和生物效應(yīng)，并具有極強(qiáng)的殺菌效能［1-2］.與其他納米材料一樣，納米銀具有量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)以及光催化性等獨(dú)特的性能.這些特性使納米銀廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、電學(xué)、光學(xué)等各個方面，成為商品化程度最高的納米材料.在骨植入手術(shù)中，用納米銀作為抗菌劑，既有良好的抗菌效應(yīng)，又能將其對體內(nèi)細(xì)胞的毒性降到最低.納米銀可通過多種途徑進(jìn)入人體，與人體的組織、細(xì)胞甚至生物大分子直接接觸，并可能產(chǎn)生多種生物效應(yīng)，對人類健康產(chǎn)生潛在影響.研究表明，納米銀作用于胚胎干細(xì)胞時，可以引起細(xì)胞線粒體功能的損傷和LDH水平的升高［3］;納米銀還會引起動物體內(nèi)多個臟器發(fā)生病理改變［4-6］.因此，納米銀的生物安全性受到極大關(guān)注.了解納米銀的生物分布是研究其生物效應(yīng)的前提，需要定量檢測出納米銀在不同組織器官中的分布.相關(guān)報道表明，納米銀可從暴露部位穿越生物屏障進(jìn)入體循環(huán)，進(jìn)而分布到全身不同組織［5-7］.體內(nèi)動力學(xué)行為的研究有助于了解納米銀在生物轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化過程中的動態(tài)規(guī)律;根據(jù)所得的動力學(xué)參數(shù)，闡述一定劑量、途徑下納米銀的吸收、分布、消除特征，為完善納米材料毒性研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計提供依據(jù).本文采用靜脈注射的方式將納米銀注入小鼠體內(nèi)，采用ICP-MS法檢測納米銀在體內(nèi)的生物分布情況，為進(jìn)一步研究納米銀的生物學(xué)效應(yīng)和生物應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

主要試劑包括:粒徑為12～20 nm的納米銀粉體(上海滬正納米科技有限公司);BV-Ⅲ級硝酸(北京化學(xué)試劑研究所);MOS級質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫(北京化學(xué)試劑化學(xué)所);Ag標(biāo)準(zhǔn)溶液(國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院);In標(biāo)準(zhǔn)溶液(國家鋼鐵材料測試中心鋼鐵研究總院).

主要儀器包括:X7型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Thermo Elemental公司);AT201型電子天平(瑞士Mettler-Toledo儀器有限公司);Milli-Q純水儀(美國Millipore公司);S-4800型掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司);Nano-ZS90型粒徑分析儀(英國Malvern公司).

1.2 納米銀的材料表征

經(jīng)過掃描電鏡分析后，將納米銀粉體分散在生理鹽水中.渦旋混勻后采用超聲處理45 s，以達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài).然后，用粒徑分析儀分析溶液中粒子的粒徑.

1.3 動物

實(shí)驗(yàn)中所用的ICR小鼠購自江蘇省南京市青龍山動物繁殖場，動物許可證號為scxk(蘇)2008-0010.實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院SPF實(shí)驗(yàn)動物中心，嚴(yán)格控制飼養(yǎng)環(huán)境:溫度為(22±2)℃，相對濕度為(65±10)%，正常通風(fēng)換氣，每日人工照明12 h.小鼠飼養(yǎng)于墊有消毒木屑的塑料籠內(nèi)，每籠5只，每周更換墊料2次.在整個實(shí)驗(yàn)中，小鼠可以自由飲用滅菌去離子水和攝入標(biāo)準(zhǔn)飼料.

1.4 納米銀在小鼠血液中的動力學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)中選用90只ICR小鼠，其體重為24～26 g，隨機(jī)分為9組，其中8組為實(shí)驗(yàn)組，1組為對照組，將質(zhì)量比為120 μg/g的納米銀溶液尾靜脈注射入小鼠體內(nèi).染毒時，將小鼠扣住，固定尾部使小鼠尾巴繃直，緩慢地將注射器插入尾靜脈中，單只動物染毒在40 s內(nèi)完成.對照組注射生理鹽水.納米銀溶液于臨用前配制.染毒后，按照不同時間點(diǎn)(0.15，0.3，0.5，1，3，6，12，24 h)分批摘除眼球取血，每只動物取血量為 0.7 ～1.0 mL.對照組于24 h時摘除眼球取血.血樣于－60℃下保存待測.利用ICP-MS檢測血液中的w(Ag)后，采用DAS藥物動力學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計算濃度-時間曲線下面積(Ac-t)、半衰期(t1/2)、平均駐留時間(TMR)、清除率(CL)以及分布容積(Vd)等動力學(xué)參數(shù).其中，濃度-時間曲線下面積是指血液中的w(Ag)對時間作圖所得曲線下的面積，積分求得;半衰期是指血液中的w(Ag)下降一半所需要的時間，即t1/2=0.693/k，其中k為消除速率常數(shù);平均駐留時間是指納米銀在體內(nèi)的平均駐留時間，大于消除半衰期;清除率是指單位時間內(nèi)生物體所有途徑能夠消除的納米銀占有的血漿容積值，即CL=kVd=X0/Ac-t，其中X0為染毒質(zhì)量濃度;分布容積是指1 kg生物體中納米銀均勻分布時所占體液的體積，即Vd=X0/C0，其中C0為染毒開始時血液中納米銀的質(zhì)量濃度.

1.5 納米銀在小鼠體內(nèi)的分布

實(shí)驗(yàn)中選用80只ICR小鼠，其體重為24～26 g，隨機(jī)分為8組，其中5組為實(shí)驗(yàn)組，3組為對照組.染毒質(zhì)量濃度和方式同1.4節(jié).染毒后，按照設(shè)定時間點(diǎn)(0.25，0.5，1，7，14 d)剖取肺、肝、脾、腎.向?qū)φ战M注射生理鹽水，并于1，7，14 d剖取肺、肝、脾、腎.對臟器進(jìn)行稱重，計算出臟器系數(shù)，而后置于－60℃下保存待測.

1.6 樣品處理與ICP-MS分析

稱量血液樣本約0.1 mL或組織樣品40～80 mg，置于錐形瓶中，加入5 mL HNO3，靜置過夜.次日，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2O2溶液.將混合物置于電熱板上消解，電熱板緩慢升溫至200℃，使錐形瓶中的混合物揮發(fā)至1 mL左右，再將液體轉(zhuǎn)移到離心管中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的HNO3溶液將其定容至 10 mL，進(jìn)行 ICP-MS分析［8］.配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)銀溶液，用以繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行納米銀的定量檢測.標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=5 741.5X+138，相關(guān)系數(shù)為0.999 9.

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差相組合的方式表示，用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析.實(shí)驗(yàn)組與對照組的比較采用Dunnett's法，實(shí)驗(yàn)組之間的兩兩比較采用LSD法、SNK法或Dunnett's法，當(dāng)p＜0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 納米銀的表征結(jié)果

掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示，納米銀粉體中顆粒分散均勻，無團(tuán)聚現(xiàn)象(見圖1).粒徑分析結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度為12 mg/mL的納米銀溶液中顆粒大小不均勻，平均粒徑為54.99 nm，較粉體狀態(tài)時稍大(見表1).

圖1 納米銀的掃描電子顯微鏡照片

表1 納米銀溶液中顆粒粒徑分布表

2.2 血液中的w(Ag)和動力學(xué)參數(shù)

納米銀以120 μg/g的劑量經(jīng)小鼠尾靜脈注射到生物體內(nèi)后，血液中w(Ag)的經(jīng)時變化見圖2.血液中的w(Ag)在1 h內(nèi)呈快速下降趨勢，1 h時出現(xiàn)一谷濃度，隨后w(Ag)略有升高，并在24 h內(nèi)呈平穩(wěn)狀態(tài).對照組血樣中w(Ag)等于0.

圖2 不同時間點(diǎn)小鼠血液中的w(Ag)

納米銀經(jīng)過單次尾靜脈注射進(jìn)入體內(nèi)后，根據(jù)血液中w(Ag)的變化，采用DAS藥物動力學(xué)軟件計算得到主要動力學(xué)參數(shù).10只小鼠血液中的平均動力學(xué)參數(shù)見表2.

表2 尾靜脈注射納米銀后10只小鼠血液中的平均動力學(xué)參數(shù)

2.3 臟器中的w(Ag)

對小鼠尾靜脈注射納米銀溶液后，于1，7，14 d剖取主要臟器(肺、肝、脾和腎)，稱重計算臟器系數(shù).在每個對照組和實(shí)驗(yàn)組中，均對10只小鼠主要臟器的臟器系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見表3.由表可知，染毒1 d后的脾臟(p=0.001)、7 d后的腎臟(p=0.044)、14 d 后的肝臟(p=0.00)和脾臟(p=0.002)的臟器系數(shù)與相應(yīng)時間對照組結(jié)果比較具有統(tǒng)計學(xué)差異.

表3 小鼠主要臟器的臟器系數(shù)

小鼠染毒后，按照設(shè)定時間點(diǎn)剖取臟器，利用ICP-MS檢測臟器中的w(Ag)，統(tǒng)計結(jié)果見圖3.由圖可知，各時間點(diǎn)脾臟中的w(Ag)最高，是腎臟中的20～80倍，隨著時間的變化，脾臟中的w(Ag)并未出現(xiàn)明顯降低;染毒1 d內(nèi)肝臟中的w(Ag)約為120 μg/g，1 d后此數(shù)值明顯降低;肺臟中的w(Ag)在染毒1 d后開始顯著下降;腎臟中的w(Ag)在染毒14 d后略有升高.

圖3 不同時間點(diǎn)小鼠主要臟器中的w(Ag)

3 討論

在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域，含有納米銀的醫(yī)療產(chǎn)品與人體密切接觸，其負(fù)載的納米銀可能在人體內(nèi)蓄積而產(chǎn)生潛在影響［9］.現(xiàn)有研究表明，納米銀具有神經(jīng)毒性［10］、細(xì)胞毒性［3，11］和蓄積性［12］，因此其生物安全性及生物學(xué)效應(yīng)備受關(guān)注.了解納米銀的生物分布是研究納米銀生物學(xué)效應(yīng)的前提.本文利用尾靜脈注射的方法，模擬納米銀直接與生物血液接觸，研究其在血液中的動力學(xué)變化以及生物分布.

單次尾靜脈注射納米銀后，1 d內(nèi)定時取血，檢測血液中的w(Ag).血液中約90%的銀在1 h內(nèi)消除，血液動力學(xué)分析結(jié)果顯示:血液中銀的消除半衰期為(22.81 ±10.85)h.1 h后血液中的w(Ag)略有升高，這可能是由于納米銀到達(dá)各個臟器后重新分布的結(jié)果.注射1 d后，各主要臟器中的w(Ag)均較高，特別是在肝臟和脾臟中，w(Ag)分別是血液中的53倍和80倍，表明納米銀對肝臟和脾臟有較強(qiáng)的組織親和性，其蓄積器官與納米四氧化三鐵的蓄積器官相近［13］.利用DAS藥物動力學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，經(jīng)統(tǒng)計矩非房室模型擬合，獲得納米銀在血液中的動力學(xué)參數(shù).血液中銀的消除半衰期為(22.81±10.85)h，清除率為(0.89 ±0.24)L/(h·kg)，分布容積為(26.84 ±8.96)L/kg;大的分布容積為納米銀可能在組織器官中產(chǎn)生蓄積提供了數(shù)據(jù)支持.這與Chen等［14］的研究結(jié)果一致.組織分布研究表明，納米銀可迅速分布至肺、肝、脾、腎等主要臟器，特別是在肝臟和脾臟中，染毒14 d后w(Ag)仍然維持在較高水平，說明納米銀在肝臟和脾臟存在蓄積.此外，實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)其他組織器官中也有少量的納米銀檢出，檢出量小于1 μg/g.

已有研究發(fā)現(xiàn)，納米銀可能導(dǎo)致肝臟［4-5］和肺臟［4-6］發(fā)生組織病理改變.在本文實(shí)驗(yàn)中，染毒6 h后肝臟中的w(Ag)為 139.25 μg/g，1 d 后開始明顯降低，由此推測，小鼠體內(nèi)部分納米銀在染毒1 d后就開始通過肝臟排泄.這與Fuchner等［15］的研究結(jié)果一致.脾臟中的w(Ag)是各主要臟器中最高的，且滯留量至14 d時仍未出現(xiàn)明顯的降低趨勢;肝臟中的w(Ag)次之.因此，脾臟和肝臟是納米銀主要的蓄積作用靶器官.經(jīng)皮下植入的納米銀同樣可以在動物的多個臟器中蓄積，其中脾臟中的w(Ag)最高，約為腎臟中的 1.5 倍［16］.經(jīng)呼吸道進(jìn)入生物體內(nèi)的納米銀主要蓄積于肺臟［5］，這可能與納米材料的暴露方式不同有關(guān).由此推測，不同納米材料經(jīng)過不同的途徑進(jìn)入生物體內(nèi)，其蓄積作用靶器官不同.

4 結(jié)語

根據(jù)納米銀在小鼠體內(nèi)的血液動力學(xué)和組織分布情況得出，納米銀具有較高的組織親和力，且脾臟和肝臟可能是納米銀的主要蓄積作用靶器官.納米材料的多樣性及其所具有的尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)等特性，都可能影響其在體內(nèi)的動力學(xué)變化和生物分布，從而影響其生物效應(yīng).因此，對納米材料體內(nèi)動力學(xué)變化和組織分布的深入研究，有助于闡明作用靶器官，為揭示作用機(jī)制和安全性評價奠定基礎(chǔ).

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Biodistribution of nanosilvers in mice

Zhang Shanshan1，2，3Xue Yuying1，2，3Tang Meng1，2，3Zhang Ting1，2，3Liu Xiaorun1，2，3Zhang Peng4Zhang Zhiyong4

(1Key Laboratory of Environmental Medicine and Engineering of Ministry of Education，Southeast University，Nanjing 210009，China)
(2Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials and Devices，Southeast University，Nanjing 210009，China)
(3School of Public Health，Southeast University，Nanjing 210009，China)
(4Institute of High Energy Physics，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China)

Nanosilvers dissolved in saline were injected intravenously by tail vein into mice.The concentration of nanosilvers in blood and organs was detected by the inductively coupled plasma mass spectrometry(ICP-MS)，and the kinetic parameters in blood were evaluated by the drug and statistical software(DAS).The experimental results indicate that the concentration of nanosilvers in blood is dropped rapidly in one hour after injection，and gradually becomes stable in the following 24 h.The elimination half-life in blood is 22.8 h，and the volume of distribution is 26.8 L/kg.After injection，the nanosilvers are quickly distributed to the organs following blood circulation.After 6 h the nanosilver can be detected in the main organs，and the maximum concentration of nanosilvers，about 203 μg/g，is in spleen.The majority of the nanosilvers are accumulated in liver and spleen.Therefore，nanosilvers have good biocompatibility with the tissues.The liver and spleen are the main target organs for nanosilvers.

nanosilver;tail vein injection;biodistribution

R994.6

A

1001－0505(2012)02-0388-05

10.3969/j.issn.1001 －0505.2012.02.037

2011-08-19.

張姍姍(1985—)，女，碩士生;薛玉英(聯(lián)系人)，女，博士，教授，yyxue@seu.edu.cn.

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項(xiàng)目(2011CB933404)、國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30972504)、江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK2011606)、東南大學(xué)科技基金資助項(xiàng)目(KJ2010440).

張姍姍，薛玉英，唐萌，等.納米銀在小鼠體內(nèi)的組織分布［J］.東南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2012，42(2):388-392.［doi:10.3969/j.issn.1001 －0505.2012.02.037］