陳洪昌 張惠琴 陳建軍 李國(guó)疆 李文華

1.成都市新都區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉科，四川成都 610500；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院耳鼻喉科，貴州貴陽(yáng) 550004

鼻咽癌（nasopharyngeal carrinoma，NPC）是東南亞地區(qū)，尤其是中國(guó)南方高發(fā)惡性腫瘤之一，在我國(guó)南方其發(fā)病率居耳鼻咽喉科惡性腫瘤之首，但其發(fā)病機(jī)制尚未明確。近年來(lái)，從分子水平對(duì)癌基因和抑癌基因與腫瘤關(guān)系的研究日益增多。P16 即多發(fā)性腫瘤擬制基因，其蛋白可與細(xì)胞周期素cyclinD1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CDK4 和CDK6，并特異性地抑制CDK4的活性，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期和DNA合成的啟動(dòng)[1]。P16 在cyclinD-CDK4/6-PRb-E2F細(xì)胞周期調(diào)節(jié)途徑中起負(fù)反饋?zhàn)饔?，一旦P16 基因發(fā)生變異，上述環(huán)路無(wú)限制進(jìn)行下去，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。bcl-2 即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因2，屬于參與凋亡調(diào)控的基因家族。Bcl-2 在線粒體上可直接調(diào)節(jié)膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔來(lái)調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，以阻止細(xì)胞色素C釋放入胞質(zhì)而抑制細(xì)胞凋亡[2]。本課題用免疫組化方法研究鼻咽癌和鼻咽慢性炎癥黏膜組織中P16 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)情況，從而分析P16 和Bcl-2 蛋白在鼻咽癌發(fā)病機(jī)制中所起的作用以及兩者的相關(guān)性，以期為臨床診斷、治療鼻咽癌，降低鼻咽癌復(fù)發(fā)率提供新的理論依據(jù)和方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)選取2010年3月～2010年6月于我院經(jīng)耳鼻咽喉科活檢、資深病理科醫(yī)師確診且病歷資料完整的40例鼻咽部鱗狀細(xì)胞癌患者的鼻咽部組織蠟塊，并隨機(jī)選取同期確診為鼻咽部慢性炎癥的患者組織蠟塊16例。40例鼻咽部鱗狀細(xì)胞癌患者中，男36例，女4例；高分化癌2例，中分化癌4例，低分化癌34例；有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。

1.2 方法

采用免疫組化SP法檢測(cè)P16 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)情況。免疫組化染色按SP試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，采用PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照。主要步驟包括：切片、脫蠟、梯度酒精水華，抗原修復(fù)、孵化、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、封片觀察[3]。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

顯微鏡下觀察P16 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)情況。免疫組化染色陽(yáng)性細(xì)胞觀察標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)有棕黃色顆粒判斷為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)理論頻數(shù)＜1 時(shí)采用Fisher確切概率法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中P16 蛋白表達(dá)與組織分化程度的關(guān)系

從表1 中可以看出，P16 蛋白的缺失與鼻咽部鱗狀細(xì)胞癌的分化程度有著密切的關(guān)系，P16 蛋白多見于高分化組織中（χ2=8.682，P＜0.05）。P16 在鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)情況，見圖1。

表1 鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中P16蛋白表達(dá)與組織分化程度的關(guān)系（例）

圖1 P16 陽(yáng)性表達(dá)的免疫組化圖（×400）

2.2 鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中P16 蛋白表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

從表2 中可以看出，有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中P16 表達(dá)陽(yáng)性率為27.8%（5/18），無(wú)頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移鼻咽癌組織中P16 表達(dá)陽(yáng)性率為36.4%（8/22），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.402，P ＞ 0.05）。

表2 鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中P16蛋白表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系（例）

2.3 鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中P16 表達(dá)與鼻咽癌臨床分期的關(guān)系

按照慣例，將臨床鼻咽癌Ⅰ期和 Ⅱa期、Ⅱb期劃分為癌癥早期，將Ⅲ期和Ⅳ期劃分為癌癥晚期。由表3 可見，早期與晚期比較，P16 蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=1.432，P＞0.05）。

表3 鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中P16表達(dá)與鼻咽癌臨床分期的關(guān)系（例）

2.4 鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Bcl-2 蛋白表達(dá)與組織分化程度的關(guān)系

從表4 中可以看出，40例鼻咽癌組織中bcl-2 的表達(dá)隨分化程度的升高而降低，不同分化程度間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.512，P＜0.05）。Bcl-2 在鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)情況，見圖2。

表4 鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Bcl-2表達(dá)與組織分化程度的關(guān)系（例）

圖2 bcl-2 陽(yáng)性表達(dá)的免疫組化圖（×400）

2.5 鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Bcl-2 蛋白表達(dá)與鼻咽癌臨床分期的關(guān)系

按照慣例，將鼻咽癌臨床Ⅰ期和 Ⅱa期、Ⅱb期劃分為癌癥早期，將Ⅲ期和Ⅳ期劃分為癌癥晚期。由表5 可見，早期與晚期比較，Bcl-2 表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=6.488，P＜0.05）。

表5 鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中bcl-2表達(dá)與鼻咽癌臨床分期的關(guān)系（例）

2.6 鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中bcl-2 蛋白表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

從本研究表6 可以看出，在18例有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，Bcl-2 表達(dá)陽(yáng)性的有16例，占88.9%，在22例頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的患者中，有18例Bcl-2 表達(dá)為陽(yáng)性，占81.8%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Bcl-2 的表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.306，P ＞ 0.05）。

表6 鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Bcl-2表達(dá)與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系（例）

2.7 P16 和Bcl-2 蛋白在鼻咽部慢性炎癥組織中的表達(dá)

本研究中表7 可以看出，P16 和Bcl-2 蛋白在鼻咽部慢性炎癥組織中表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=10.490，P＜0.001）。P16 在鼻咽部慢性炎癥組織中明顯呈高表達(dá)，陽(yáng)性率為68.7%，而Bcl-2 在鼻咽部慢性炎癥組織中明顯呈低表達(dá)，陽(yáng)性率為12.5%。

表7 P16和Bcl-2在鼻咽部慢性炎癥組織中的表達(dá)（例）

2.8 鼻咽癌組織P16 和Bcl-2 蛋白表達(dá)的相關(guān)性

在鼻咽部鱗狀細(xì)胞癌組織中，P16 的表達(dá)和Bcl-2 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（P ＜ 0.05，r=-0.844 8）。 見表8。

表8 鼻咽癌組織P16和Bcl-2蛋白的表達(dá)的相關(guān)性（例）

3 討論

近年來(lái)，人們對(duì)鼻咽癌的研究越來(lái)越深入，其中，對(duì)癌基因和抑癌基因的研究也逐漸成為熱點(diǎn)[4]?，F(xiàn)在越來(lái)越多的證據(jù)表明，P16 和Bcl-2 蛋白在鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。在細(xì)胞增殖的調(diào)控中，P16 蛋白發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)的作用，P16 的失活會(huì)導(dǎo)致CDK4 的活性增強(qiáng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞非正常增殖致使腫瘤形成。但P16 基因直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的報(bào)道較少，而從已知的P16 基因作用機(jī)制和凋亡調(diào)節(jié)機(jī)制分析，P16可能并不直接參與凋亡的發(fā)生，而是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期與誘導(dǎo)凋亡因子共同作用誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。本研究中，P16 蛋白在慢性炎癥組織中的表達(dá)率為68.7%，在鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)率為32.5%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；P16 在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的鼻咽組織中表達(dá)率為27.8%，在頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組織中的表達(dá)率為36.4%，二者有一定差異，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這說(shuō)明在鼻咽癌中P16確實(shí)有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，因此，P16 蛋白表達(dá)低下或缺失，一方面導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖，另一方面導(dǎo)致細(xì)胞凋亡機(jī)制缺陷，這可能與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系。

Bcl-2 是迄今為止研究最深入的凋亡基因之一，其表達(dá)的改變不僅影響DNA損傷細(xì)胞或周期異常細(xì)胞的正常凋亡，還影響腫瘤細(xì)胞自身的凋亡。目前Bcl-2 抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未明確。文獻(xiàn)報(bào)道Bcl-2 蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)情況為61%～86%[5-6]。正常鼻咽黏膜由基底細(xì)胞發(fā)生，向表層細(xì)胞移行，分化成熟，有旺盛增殖能力的基底層細(xì)胞有Bcl-2 的低表達(dá)，而基底層以上細(xì)胞無(wú)Bcl-2 表達(dá)。本研究用免疫組化的方法檢測(cè)Bcl-2 蛋白在鼻咽癌組織和鼻咽黏膜慢性炎癥組織中的表達(dá)率分別是 85.0%（34/40）、12.5%（2/16），結(jié)果與文獻(xiàn)一致[5-6]。由于在鼻咽癌中Bcl-2 的表達(dá)增強(qiáng)與P16 的失活同時(shí)存在，推測(cè)P16 失活后失去對(duì)Bcl-2 表達(dá)的抑制可能是Bcl-2 表達(dá)增加的原因。Bcl-2 基因通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，增加細(xì)胞其他基因突變機(jī)會(huì)或使突變基因在細(xì)胞內(nèi)積聚導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致細(xì)胞腫瘤的發(fā)生發(fā)展。從本研究結(jié)果可見，Bcl-2 在鼻咽部慢性炎癥組織中明顯呈低表達(dá)，陽(yáng)性率為12.5%，而在鼻咽癌組織中的表達(dá)率為85.0%（34/40），呈高表達(dá)；Bcl-2 蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率在有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的鼻咽癌組織中比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在不同臨床分期中，鼻咽癌早期和晚期的Bcl-2 蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），從一定程度上說(shuō)明了Bcl-2 在鼻咽鱗狀細(xì)胞癌的異常表達(dá)是鼻咽癌比較早期的事件，表達(dá)程度與鼻咽癌的臨床分期有關(guān)系，和鼻咽癌的頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系不密切。

綜上所述，P16 在鼻咽部慢性炎癥組織中高表達(dá)，在鼻咽鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá)。因此，P16 檢測(cè)可以為鼻咽癌早期診斷提供依據(jù)，伴有P16 缺失可能是早期鼻咽癌的一個(gè)特點(diǎn)。Bcl-2 在分化程度低的癌組織中高表達(dá)，在分化程度高的癌組織中低表達(dá)；在晚期鼻咽鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，在早期鼻咽鱗狀癌中低表達(dá)。因此，Bcl-2 蛋白檢測(cè)可以作為判斷鼻咽癌病情和預(yù)后的指標(biāo)，也可以通過(guò)動(dòng)態(tài)檢測(cè)Bcl-2 來(lái)監(jiān)測(cè)病情變化。在鼻咽鱗狀細(xì)胞癌中，Bcl-2 高表達(dá)，P16 低表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。由此可見，通過(guò)基因治療，降低Bcl-2的表達(dá)，提高P16 的表達(dá)是治療鼻咽癌的方向。聯(lián)合檢測(cè)二者，可以作為評(píng)價(jià)治療是否有效的指標(biāo)。

[1] 鐘守軍，姚運(yùn)紅.鼻咽癌P16 基因研究進(jìn)展[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥科技，2004，4（3）：114.

[2] 張光謀，許重潔.心肌肥大大鼠心肌細(xì)胞凋亡與Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的變化[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2009，38（4）：396-397.

[3] 竇東偉，李佳荃，李裕波.肝組織石蠟切片8-OhdG免疫組化方法的研究[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，28（3）：352-353.

[4] 金學(xué)軍，劉錦全，柳子川，等.甘氨雙唑鈉在鼻咽癌放療中增敏作用的臨床研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊，2011，13（5）：844-845.

[5] Warr MR，Shore GC.Small-molecule Bcl-2 antagonists as targeted therapy in oncology[J].Current Oncology，2008，15（6）：256-261.

[6] Cory S，Huang DC，Adams JM.The Bcl-2 family：roles in cell survival and oncogenesis[J].Oncogene，2003，22（53）：8590.