李 華 ，龍亞秋 ，羅超華 ，楊 芳

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515; 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120;3.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515)

硫酸長(zhǎng)春新堿為抗腫瘤類原料藥，中國(guó)藥典中其有關(guān)物質(zhì)測(cè)定采用高效液相色譜法[1]。由于產(chǎn)品工藝中的起始原料發(fā)生變更，可能帶入新雜質(zhì)，為此筆者參閱歐洲藥典(EP 7.0版)和美國(guó)藥典(USP 34版)，對(duì)中國(guó)藥典所述有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法進(jìn)行了驗(yàn)證?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

島津LC－20A型高效液相色譜儀，LC Solution色譜工作站;Sartorius－BP210型電子天平。硫酸長(zhǎng)春新堿對(duì)照品、硫酸長(zhǎng)春堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為100130－200502);硫酸長(zhǎng)春新堿原料藥(廣州綠葉化工有限公司，批號(hào)為100701，100702，100703);甲醇為色譜純，水為純化水，其余均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Shiseido C8柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:取二乙胺15 mL，加水985 mL，用磷酸調(diào)pH至7.5，作為流動(dòng)相A，甲醇為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫(0～12 min時(shí)A體積分?jǐn)?shù)為38%，12～27 min時(shí)A體積分?jǐn)?shù)由38%線性變化至8%，27～29 min時(shí)，A體積分?jǐn)?shù)由8%線性變化至38%，29～34 min時(shí)維持A體積分?jǐn)?shù)為38%);檢測(cè)波長(zhǎng):297 nm;柱溫:30℃;流速:1.5 mL/min。

2.2 溶液制備

取本品，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液，作為高濃度供試品溶液;精密量取1 mL，置25 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為低濃度供試品溶液。取硫酸長(zhǎng)春新堿及硫酸長(zhǎng)春堿對(duì)照品適量，用水溶解并稀釋制成每1 mL分別含有1 mg的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn):在擬訂的色譜條件下，精密吸取系統(tǒng)適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀。結(jié)果硫酸長(zhǎng)春新堿的保留時(shí)間約為15 min，硫酸長(zhǎng)春堿峰與硫酸長(zhǎng)春新堿峰的分離度應(yīng)大于4.0，見(jiàn)圖 1。

專屬性試驗(yàn):取水(溶劑空白)20 μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果表明溶劑對(duì)雜質(zhì)測(cè)定無(wú)干擾。取系統(tǒng)適用性溶液和高濃度供試品溶液各20 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果硫酸長(zhǎng)春堿峰與硫酸長(zhǎng)春新堿主峰之間的分離度大于4.0，硫酸長(zhǎng)春新堿峰與相鄰各雜質(zhì)峰之間的分離度均大于1.5(見(jiàn)表 1 和表 2、圖 1)，表明方法的專屬性較好。

圖1 高效液相色譜圖

表1 已知物質(zhì)的分離度測(cè)試

線性關(guān)系考察:取硫酸長(zhǎng)春堿對(duì)照品約25 mg，精密稱定，用水溶解并稀釋至質(zhì)量濃度為0.1 g/L，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液A;精密吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液A 1 mL，用水稀釋至10 mL，質(zhì)量濃度0.01 g/L，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液B。取硫酸長(zhǎng)春新堿樣品約0.1 g，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，混合均勻，質(zhì)量濃度約為10 g/L，作為標(biāo)準(zhǔn)貯備液 C。分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)貯備液 B 0.5，1.0，5.0 mL 和標(biāo)準(zhǔn)貯備液 A 1，2，4，5 mL，各置 10 mL 容量瓶中，精密吸取1 mL，用水稀釋至刻度，混合均勻，得到編號(hào)1－7的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液C，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為高濃度樣品溶液;取1.0 mL高濃度樣品溶液，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為低濃度樣品溶液。取編號(hào)1－7的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣，每個(gè)質(zhì)量濃度連續(xù)進(jìn)樣3次。以硫酸長(zhǎng)春堿為代表雜質(zhì)，其實(shí)際質(zhì)量濃度在 0.510 ～51.04 μg/mL，(相當(dāng)于0.05% ～5.0%)范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為 Y=0.000 01 X －0.147 5，r=0.999 98。

表2 樣品存在雜質(zhì)的分離度測(cè)試

精密度試驗(yàn):分別取硫酸長(zhǎng)春堿、硫酸長(zhǎng)春新堿對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積的 RSD硫酸長(zhǎng)春堿為0.20%(n=6)，硫酸長(zhǎng)春新堿為 0.11%(n=6)，均小于 2.0% ，表明方法精密度高。

重復(fù)性試驗(yàn):取同一份樣品共6份，依法測(cè)定。結(jié)果峰面積的RSD硫酸長(zhǎng)春堿為0.24%(n=6)，硫酸長(zhǎng)春新堿為0.14%(n=6)，均小于2.0%，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):稱取已知含量的的原料藥6份，分別精密加入對(duì)照品適量，依法制備溶液并測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。硫酸長(zhǎng)春新堿的回收率均在98.0% ～102.0%范圍內(nèi)，符合要求。

表3 硫酸長(zhǎng)春新堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

檢測(cè)限及定量限確定:該方法的定量限和檢測(cè)限以硫酸長(zhǎng)春堿作為雜質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。取線性關(guān)系考察項(xiàng)下編號(hào)1和2的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。當(dāng)待測(cè)組分的信噪比為2～3倍，對(duì)應(yīng)該組分的最小檢測(cè)質(zhì)量濃度為0.51 μg/mL，相當(dāng)于0.05%;當(dāng)信噪比10～20倍時(shí)，對(duì)應(yīng)該組分的最小定量質(zhì)量濃度為 1.02 μg/mL，相當(dāng)于 0.1%。結(jié)果表明，該方法的靈敏度足以用于硫酸長(zhǎng)春新堿雜質(zhì)的檢測(cè)。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一樣品，依法制備供試品溶液，于2，4，8，12，24 h時(shí)分別進(jìn)樣。結(jié)果硫酸長(zhǎng)春堿與硫酸長(zhǎng)春新堿峰面積響應(yīng)值的 RSD分別為0.35%和0.17%(n=5)，表明該方法所用溶液穩(wěn)定性良好。

可變參數(shù)耐用性試驗(yàn):取系統(tǒng)適用性溶液(含有硫酸長(zhǎng)春新堿及其主要雜質(zhì)硫酸長(zhǎng)春堿)，除可變的條件外，其他參數(shù)均與常規(guī)分析條件一致，依法進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)表4?？梢?jiàn)，對(duì)流動(dòng)相比例、柱溫、流速、流動(dòng)相pH作一定程度的改變時(shí)，均可維持硫酸長(zhǎng)春堿與硫酸長(zhǎng)春新堿分離度大于4的系統(tǒng)適用性要求，表明方法的耐用性較好。

表4 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

取起始原料變更前后的3批樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在擬訂的色譜條件下進(jìn)行分析，記錄色譜圖，按自身對(duì)照法以峰面積計(jì)算雜質(zhì)含量。結(jié)果見(jiàn)表5?？梢?jiàn)，起始原料變更后無(wú)新雜質(zhì)產(chǎn)生，原有雜質(zhì)含量比起始原料變更前雜質(zhì)含量有所降低。

表5 硫酸長(zhǎng)春新堿的有關(guān)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)針對(duì)硫酸長(zhǎng)春新堿原料藥的起始物料來(lái)源發(fā)生變更，按現(xiàn)行版藥典的要求，對(duì)中國(guó)藥典收載的硫酸長(zhǎng)春新堿有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法進(jìn)行了詳盡而全面的方法學(xué)考察，重點(diǎn)考察專屬性與耐用性。結(jié)果表明，該方法專屬性、重復(fù)性良好，方法準(zhǔn)確，檢測(cè)靈敏度高，耐用性好，可用于起始原料變更后的產(chǎn)品有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)。

在專屬性考察中，除關(guān)注已知雜質(zhì)硫酸長(zhǎng)春堿與主分硫酸長(zhǎng)春新堿的分離情況，更特別關(guān)注樣品中實(shí)際存在的雜質(zhì)與主成分的分離度，試驗(yàn)結(jié)果符合測(cè)定要求。此外，還從溶液穩(wěn)定性、流動(dòng)相比例、溫度、流速和pH等幾個(gè)方面考察了方法的耐用性，測(cè)定結(jié)果令人滿意。通過(guò)方法學(xué)考察，為該產(chǎn)品雜質(zhì)質(zhì)量控制方法的可靠性和適用性提供了充分的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(二部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:953－954.