葉其蓁，周子曄，林觀樣

(浙江省溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000)

何首烏 Polygonum multiflorum Thunb.為蓼科植物，塊根與葉均可入藥，浙江、江蘇、湖南、貴州等全國多數(shù)省份均有產(chǎn)。其以根入藥，具有解毒、消癰、截瘧、潤腸通便的功效;以葉入藥，具有治瘡腫、疥癬、瘰疬的功效[1]。大黃素是何首烏的主要藥用成分[2]，具有廣泛的生物活性，具有抗菌、抗病毒、抗炎、改善肝腎功能、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用等[3]。生長環(huán)境對藥材的主要成分構(gòu)成與含量均有影響，為科學考察溫州地區(qū)產(chǎn)野生何首烏的質(zhì)量，本試驗中擬以大黃素為指標進行含量測定，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

美國Agilent 1100系列液相色譜儀，包括四元泵、紫外檢測器;UPWS超純水器(杭州永潔達凈化科技有限公司);TU－1901型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);KQ－5000DE型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。大黃素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為756－8902);甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。藥材樣品采自瑞安花巖森林公園，經(jīng)溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院藥劑科林觀樣老師鑒定為蓼科何首烏 Fallopia multiflora(Thunb.)Harald.，標本保留在溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院中藥房標本室。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Zorbax Ecilpse XDBC18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:甲醇－1%冰醋酸(70∶30);流速:1.5 mL/min;柱溫:40 ℃;進樣量:20 μL。高效液相色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

稱取大黃素對照品5.0 mg，精密稱定，以甲醇溶解并定容至10 mL，搖勻，配成質(zhì)量濃度為500 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。取新鮮何首烏根與葉適量，分別于10℃陰干研細，精密稱取葉 10.00 g 和根 5.00 g，分別置100 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇25 mL，精密稱定，50℃超聲提取30 min，冷卻，再稱定，以甲醇補足損失的質(zhì)量，取1 mL上清液，8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心 15 min，取上清液600 μL，作為供試品溶液。

2.3 方法學考察

線性關(guān)系考察:取質(zhì)量濃度為500 μg/mL的對照品溶液，用甲醇稀釋為 500，200，50，10，5，1 μg/mL，按擬訂的色譜條件測定，每個質(zhì)量濃度重復(fù)3次。以對照品峰面積積分值為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y=24.862 X+29.723，r=0.999 5(n=6)。結(jié)果表明，大黃素質(zhì)量濃度在 1.0 ～500 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗:精密吸取同一對照品溶液，按擬訂色譜條件重復(fù)進樣6次。結(jié)果大黃素峰面積積分值的 RSD為2.63%(n=6)，表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗:精密吸取同一供試品溶液，室溫下儲存，分別于0，2，4，8，12，24 h 時進樣，測定大黃素峰面積積分值。結(jié)果的RSD=3.07%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗:取同一批樣品各6份，配置供試品溶液，分別進樣測定大黃素峰面積積分值。結(jié)果的 RSD=2.06%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗:精密稱取已知含量(104.70 μg/mL)的樣品各6份，分別精密加入大黃素對照品(50 μg/mL)1 mg，按供試品溶液制備方法以及擬訂的色譜條件，測定大黃素峰面積，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 大黃素加樣回收試驗結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測定

精密稱取陰干后何首烏根5 g(n=3)和葉10 g(n=3)樣品，按2.2項下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL進樣，測定大黃素含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品中大黃素含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

筆者選擇了兩種流動相系統(tǒng)進行試驗，甲醇－0.1%磷酸(70∶30)與甲醇－0.1%冰醋酸(70∶30)，結(jié)果均能達到滿意的分離效果，大黃素峰均達基線分離，峰形對稱，但前者出峰時間太晚，保留時間 17.5 min，故選擇甲醇 －0.1%冰醋酸(70∶30)作為流動相。

制備供試品溶液的過程中，選擇提取溶劑的種類和體積以及超聲提取時間作為考察因素，每個因素取3個水平進行正交試驗，結(jié)果用甲醇超聲提取30 min為最佳提取條件。離心時間低于15 min，部分樣品的上清液靜置后仍會出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象，故上清液離心時間應(yīng)不小于15 min。

試驗結(jié)果表明，浙產(chǎn)何首烏根大黃素含量為2.094 7mg/g，何首烏葉大黃素含量為0.030 3 mg/g，兩個部位大黃素含量差異明顯。該數(shù)據(jù)為浙產(chǎn)何首烏藥材的質(zhì)量控制提供了實驗室依據(jù)。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:165.

[2]方紅玫，朱延焱.何首烏有效成分、毒性作用和相關(guān)研究進展[J].國際藥學研究雜志，2010，37(4):283 －286.

[3]丁 艷，黃志華.大黃素藥理作用研究進展[J].中國藥理與臨床，2007，23(5):235 －238.