詹文捷唐由之江偉梁麗娜馬群英李嬌祁鑫張蕓

兩種經(jīng)口給藥方法治療實驗性小鼠脈絡膜新生血管的比較與評價

詹文捷1，2唐由之1江偉1梁麗娜1馬群英1李嬌1祁鑫3張蕓3

目的從藥效藥理學角度評價主動口服給藥及灌胃給藥的異同，為今后兩種給藥方法的選擇提供實驗依據(jù)。方法將氪激光誘導發(fā)生脈絡膜新生血管的C57BL/6小鼠隨機分為4組：灌胃治療組，灌水對照組，飲藥治療組，飲水對照組，以正常小鼠作正常對照，不做任何處理。觀察小鼠的一般情況，分別在治療后第7天，第14天，第28天，采用ELISA檢測外周血中的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量，并在治療后28 d用FFA檢查觀察脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）面積。結(jié)果治療過程中灌胃給藥小鼠較主動口服給藥小鼠體重偏低，精神及活動度稍差，毛色也較差；給藥后第7天，14天，灌胃治療組及飲藥治療組外周血的VEGF含量均低于相應的對照組及正常組（P＜0.05），灌胃治療組和飲藥治療組之間比較無明顯差異（P=0.179）；治療后第28天行小鼠FFA檢查，灌胃治療組造影后期CNV滲漏面積明顯小于灌胃對照組（P=0.033），飲藥治療組也明顯小于飲水對照組（P=0.016），但2個治療組之間無明顯差異（P=0.701）。結(jié)論主動口服給藥可以達到與灌胃給藥相似的治療結(jié)果，對體積小的動物以及需要長期給藥的動物實驗，主動口服給藥也是一種有效的給藥方法。

灌胃；主動口服給藥；小鼠；脈絡膜新生血管

臨床上一些慢性疾病需要長期用藥治療，如高血壓、糖尿病、癌癥以及眼科的視網(wǎng)膜變性類疾病，因此相應的動物藥效藥理學研究也需要長期給藥觀察。經(jīng)口給藥是實驗動物藥理學最常見的給藥方法，灌胃法因其給藥劑量精確、可重復性強而被國內(nèi)大多數(shù)學者采用，但是該方法存在操作技術(shù)要求相對較高，對動物刺激大、容易引起食管及胃損傷，甚至因為長期灌胃的應激反應影響觀察指標等缺點，給研究者帶來一定困擾。隨著實驗動物倫理學的發(fā)展，近年來國外動物實驗采用主動口服給藥方法（將藥物加入飲用水或飼料中）逐漸增多，但是對不同經(jīng)口給藥途徑的比較和評價研究很少，國內(nèi)也未發(fā)現(xiàn)相關報道。本研究以實驗性脈絡膜新生血管小鼠做為觀察對象，將外周血中的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）含量以及脈絡膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）面積作為評價指標，比較主動口服給藥及灌胃給藥的藥效藥理學差異，為今后2種給藥方法的選擇提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

SPF級C57BL/6小鼠，雄性，體質(zhì)量20～23 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。VEGF ELISA試劑盒（由北京優(yōu)尼康生物科技有限公司提供），鹽酸氯胺酮注射液（福建古田藥業(yè)有限公司，0.1 g/支），鹽酸賽拉秦注射液（華牧動物保健品有限公司，40 mg/1支），熒光素鈉注射液（白云山明興制藥有限公司，0.6 g/支），復方托吡卡胺滴眼液（參天制藥有限公司，10 ml/支）。明睛顆粒由生蒲黃，旱蓮草等組成，其提取物由中國中醫(yī)科學院中藥所提供，相當于5.17 g生藥/g。

1.2 主要儀器

高速離心機（BY600A），酶標儀（Rayto-RT6000），多波長氪激光機（lumenis novas variaXL），眼底造影機（Topcon 501X），Imagenet 2000圖像分析軟件。

1.3 造模與分組

1.3.1 動物造模：用鹽酸氯胺酮（35 mg/kg）以及鹽酸賽拉秦（5 mg/kg）的混合液麻醉小鼠，復方托吡卡胺滴眼液散瞳，眼前放置前置鏡，經(jīng)裂隙燈用659 nm激光機圍繞視盤在血管之間光凝10點，光斑直徑為50 μm，曝光時間為0.1 s，功率為180 mW，聚焦于Bruch’s膜，見到有氣泡產(chǎn)生時提示Bruch’s膜被擊破，為有效點，若出血或無氣泡出現(xiàn)視為無效點。

1.3.2 動物分組及治療：將120只造模成功的小鼠隨機分為4組：灌胃治療組，灌水對照組，飲藥治療組，飲水對照組，每組30只。灌藥治療組：2 g/ml明睛顆粒溶液灌胃，每只小鼠灌胃0.3 ml，每日1次，相當于0.6 g/（只·d）；灌水對照組：蒸餾水0.3 ml灌胃，每日1次。飲藥治療組：根據(jù)小鼠日平均飲水量3 ml，以明睛顆粒溶液取代飲用水讓小鼠自行飲用，濃度為0.2 g/ml，相當于0.6 g/只/天；飲水對照組：正常飲用水喂養(yǎng)。30只未造模小鼠作為正常對照，正常喂養(yǎng)，不做任何治療。

1.4 觀察指標

1.4.1 一般情況觀察：小鼠飲食、體重、皮毛、活動、精神狀態(tài)等。

1.4.2 ELISA檢測外周血VEGF的含量：分別于給藥后第7天，第14天，第28天每組隨機抽取10只小鼠，摘眼球取血。血標本離心30 min（3 000 r/min），取上清10 μl，按ELISA試劑盒說明書操作。

1.4.3 FFA觀察CNV面積：給藥后第28天每組抽取10只小鼠，按照前述方法麻醉及散瞳，腹腔內(nèi)注射20%熒光素鈉0.04 ml，行FFA檢查，觀察熒光素滲漏程度。采用Imagenet 2000圖像分析軟件測量各CNV的滲漏面積，取平均值比較。

1.5 統(tǒng)計方法

統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計分析，多組之間采用完全隨機設計單因素方差分析，LSD法進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況觀察

治療過程中灌胃治療組及灌水對照組小鼠體重偏低，精神及活動度稍差，2組因灌胃意外均死亡小鼠2只。飲藥及飲水組小鼠與正常組相比體重無明顯差異，精神及活動度好，毛色正常。

2.2 小鼠外周血VEGF含量比較

給藥后第7天，灌胃治療組及飲藥治療組外周血VEGF含量均低于其相應的對照組及正常組（P＜0.05）；灌胃治療組值低于飲藥治療組，但兩者之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。給藥后第14天，各組VEGF值情況與給藥7天后相似，灌胃治療組外周血VEGF含量明顯低于灌胃對照組（P=0.003），也明顯低于正常組（P=0.002）；飲藥治療組外周血VEGF含量明顯低于飲水對照組（P=0.000）；灌胃治療組和飲藥治療組之間比較無明顯差異（P=0.179）。治療后28天，各治療組與對照組之間VEGF值相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），但各組值均低于正常對照組（P＜0.05）（表1）。

表1 各處理組小鼠用藥后不同時間與空白對照組外周血VEGF含量的同期比較（±s，pg/ml）

表1 各處理組小鼠用藥后不同時間與空白對照組外周血VEGF含量的同期比較（±s，pg/ml）

注：與灌胃治療組比較，①P＜0.05，②P＞0.05；與飲藥治療組比較，③P＜0.05，④P＞0.05。第28天，各組與正常空白組比較，P＜0.05。VEGF：血管內(nèi)皮生長因子（單因素方差分析，兩兩比較用LSD法）

12.25614.591 0.0000.000第7天第14天第28天樣本量VEGF濃度樣本量VEGF濃度樣本量VEGF濃度正?？瞻捉M1095.89±22.85①③1095.89±22.85①③1095.89±22.85灌胃對照組10102.99±28.78①10106.32±23.27①1040.15±8.01②灌胃治療組1059.53±11.421062.14±18.341050.75±7.57飲水對照組10110.88±6.60③10101.33±31.59③1054.06±9.64④飲藥治療組1077.30±16.96②1066.40±19.23②1055.10±15.99 F值P值組別3.935 0.01

2.3 小鼠眼底CNV滲漏面積比較

正常小鼠FFA表現(xiàn)：視網(wǎng)膜血管以視盤為中心呈放射狀分布，脈絡膜血管呈網(wǎng)狀分布。模型小鼠FFA表現(xiàn)：光凝部位于動脈早期出現(xiàn)強熒光，造影晚期表現(xiàn)為熒光擴大增強。灌胃治療組造影晚期CNV滲漏面積明顯小于灌胃對照組（P=0.033），飲藥治療組也明顯小于飲水對照組（P=0.016），但2個藥物治療組之間無明顯差異（P=0.701）（表2）。

表2 各組眼底光凝小鼠治療后28天FFA檢查CNV滲漏面積比較（±s，μm2）

表2 各組眼底光凝小鼠治療后28天FFA檢查CNV滲漏面積比較（±s，μm2）

注：與灌胃治療組比較，①P=0.033；與飲藥治療組比較，②P= 0.016。灌胃治療組與飲水治療組比較，P=0.701。CNV：脈絡膜新生血管（單因素方差分析，兩兩比較用LSD法）

組別樣本量CNV滲漏面積灌胃對照組85.036±1.63①灌胃治療組82.86±0.88飲水對照組105.14±1.68②飲水治療組102.99±1.35 F值3.826 P值0.019

3 討論

實驗動物藥理藥效學實驗常用的經(jīng)口給藥方法包括主動口服給藥法和灌胃法。主動口服法是將藥物混入飼料中或溶于飲水中任動物自由攝取，灌胃法是指借助器械（灌胃針）將藥物直接灌入動物胃內(nèi)。一般認為灌胃給藥能準確掌握給藥時間、給藥劑量，所以在藥理藥效實驗中普遍采用。但是灌胃法除耗費時間較多外，還對動物造成一定程度的機械和心理的影響，技術(shù)不熟練容易造成動物的死亡，尤其是小體積動物以及需要長期用藥觀察的動物，若使用灌胃給藥，會因為長期灌胃引起呼吸道損傷、胃膨脹，以及刺激肉芽組織發(fā)生。而且長期對小鼠暴力的抓取可能導致小鼠產(chǎn)生應激，引起動物生理性的一些改變，影響實驗結(jié)果〔1〕。與灌胃法相比，主動口服給藥方法簡單，也不會因操作失誤而導致動物死亡，因此，盡管此種方法存在給藥劑量難以準確衡量等缺點，但隨著實驗動物倫理學的發(fā)展及一些需要長期給藥的實驗要求，其在動物實驗中的應用將會逐漸增多。

年齡相關性黃斑變性屬于慢性進行性疾病，臨床治療周期長，1個療程多在3個月以上，給相關動物實驗帶來一定困擾，本實驗從藥效學角度探討主動口服給藥方法是否可以達到與灌胃給藥相似的效果。實驗所使用的“明睛顆粒”是國醫(yī)大師唐由之總結(jié)的涼血化瘀方的顆粒劑，該方在臨床上應用多年，對脈絡膜新生血管相關疾病如老年性黃斑變性、特發(fā)性脈絡膜新生血管（idiopathic choroidal neovascularization，ICNV）及病理性近視均顯示出較好的療效〔2-5〕；動物實驗結(jié)果表明該方藥可以抑制VEGF的表達〔5〕。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，灌胃組小鼠飲食量減少，活動度及精神較差，并有因為灌胃時誤入氣管而出現(xiàn)意外死亡的情況。藥效方面，明睛顆粒治療后第7天、第14天，自動口服給藥治療組和灌胃治療組小鼠的外周血VEGF含量均顯著低于2個對照組，灌胃組VEGF值降低更為明顯，但與口服給藥組相比差異無統(tǒng)計學意義，提示2種給藥方法對小鼠外周血VEGF含量的影響相當。從小鼠FFA檢查結(jié)果也可看出，2種給藥方法均可抑制CNV的形成及生長，療效無明顯差異。因此，從本實驗的結(jié)果來看，口服主動給藥也是一種有效的給藥方法。

綜上所述，本實驗從藥效學角度對2種經(jīng)口給藥的方式予以評價，發(fā)現(xiàn)主動口服給藥也能達到相似的治療結(jié)果。國外學者對主動口服給藥方法予以改進，將藥物與甜味劑混合后制成小藥丸或果凍形式訓練動物吞服，這樣既避免了灌胃帶來的副作用，又能保證定量給予〔6-8〕。所以，在一些動物需要長期給藥觀察，年齡小不適宜灌胃，或者灌胃者技術(shù)不熟練的情況下，我們可以考慮使用把藥物加入食物或飲用水中讓動物自行口服，從而減少對動物機體的刺激和傷害，保證實驗的順利進行。在下一步的研究中，我們將從血藥濃度等藥學角度探討2種給藥方法的異同，為今后動物實驗給藥方法的選擇提供支持和幫助。

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Comparing and evaluating the effect of two oral administration methods on experimental CNV mice

ZHAN Wenjie，TANG Youzhi，JIANG Wei，et al.Eye Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100040，China

OBJECTIVETo compare and evaluate the pharmacodynamic action of voluntary oral administration with intragastric gavage administration.METHODSC57BL/6 mice were induced CNV（choroidal neovascularization）by krypton laser and randomly divided into 4 groups:intragastric gavage control group，intragastric gavage treatment group，drinking water control group，drinking decoction treatment group.Ten normal mice were used as normal control without any treatment.The general state of health was observed.The VEGF（vascular endothelial growth factor）levels in peripheral blood were determined respectively by ELISA on day 7，14 and 28 after treatment，and the CNV leakage area was examined with FFA on day 28 of the treatment.RESULTSThe weights of mice in intragastric gavage groups were lower than that of the voluntary oral administration groups.And the spirit condition，the activity as well as the color pattern of the mice in intragastric gavage groups were also worse than that of the voluntary oral administration groups.The VEGF level in peripheral blood of the two treatment groups were significantly lower than that of its corresponding control groups and normal group on day 7 and day 14 after treatment（P＜0.05）.There were no significant differences between intragastric gavage groups and voluntary oral administration groups（P=0.179）.The CNV leakage area of FFA in the two treatment groups were significantly smaller than that of its corresponding control groups on day 28 after treatment（P＜0.05）.There was no significant difference between the intragastric gavage group and the voluntary oral administration group（P=0.701）.CONCLUSIONSVoluntary oral administration could have the same pharmacodynamic action as the method of intragastric gavage.For the long-term treating animal experiment or the experiment using tiny animals,voluntary oral administration method is an effective alternative.

intragastric gavage；voluntary oral administration；mice；CNV（choroidalneovascularization）

R-331

A

1002-4379（2012）04-0235-04

國家自然科學基金項目（81072846）

1中國中醫(yī)科學院眼科醫(yī)院，北京100040

2廣州中醫(yī)藥大學

3中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院

梁麗娜，E-mail：lianglina2001@hotmail.com