劉彥霞，陳 文，溫宗妍，趙肖萌

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京100191）

納豆激酶對角叉菜膠所致小鼠血栓模型的影響

劉彥霞，陳 文，溫宗妍，趙肖萌

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京100191）

目的：觀察納豆激酶對角叉菜膠所致的小鼠血栓模型的影響，為納豆激酶相關(guān)產(chǎn)品的溶血栓功能性評價提供依據(jù)。方法：將雌性昆明種小鼠隨機分為4組：空白組、模型對照組、低劑量組、高劑量組。連續(xù)灌胃30d，每天一次，于第30d，除空白組外，其他3組均用角叉菜膠制備尾部血栓模型，24h后觀察并測量黑尾長度，之后摘眼球取血，測定血清纖維蛋白降解產(chǎn)物（FDP）、組織型纖溶酶原激活劑（t-PA）、組織型纖溶酶原激活劑抑制劑1（PAI-1）的含量。結(jié)果：各組小鼠最后一次稱重體重?zé)o顯著性差異；低劑量組與高劑量組的出栓率低于模型對照組，但模型對照組、低劑量組、高劑量組三組間相比較，黑尾長度、黑尾/全尾長的無顯著性差異（p＞0.05）；高劑量組小鼠血清中的FDP及t-PA的含量顯著高于模型對照組和低劑量組（p＜0.05）；空白組未檢出PAI-1，其余各組PAI-1的含量無顯著性差異。結(jié)論：納豆激酶對實驗小鼠體內(nèi)血栓具有溶解作用，可以降低血栓的發(fā)生率；角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠血栓模型可以用于納豆激酶溶（抗）血栓功能評價。

納豆激酶，角叉菜膠，小鼠，尾部血栓

Abstract：Objective：Observed effect of nattokinase on the tail-thrombus model，and provided basis for the function evaluation of nattokinase product.Methods：The mice were randomly allocated into four groups（each group with 12 mice），including the normal group，the model control group，the low-dose nattokinase group，and the high-dose nattokinase group.Weighing up the mice was done every 7d.After the mice were fed for 30d，except for the normal group，other 3 groups were used to establish tail-thrombus models with carrageenan.After models were established for 24h，we observed the length of dark tails，and then detected the Fibrinogen degradation product（FDP），tissue type plasminogen activator（t-PA），and tissue type plasminogen activator inhibitor（PAI-1） in serum.Results：There was no significant difference between the length of dark tails among the model control group，the low-dose nattokinase group and the high-dose nattokinase group（p＞0.05），but the dark tail rates of the later two group were lower than the former one.The values of FDP and t-PA of the high-dose nattokinase group were higher than those of the model control group and the low-dose nattokinase group（p＜0.05）.no PAI-1 was detected in the normal，and other groups had similar values of PAI-1.Conclusions：Nattokinase was effective in dissolving blood clots，and dropping incidence of disease.Carrageenan induced tail-thrombus model could be used to evaluate the antithrombotic and fibrinolysis enhancing effects of nattokinase.

Key words：nattokinase；carrageenan；mice；tail-thrombus

血栓栓塞性疾病是目前嚴重危害中老年人健康的疾病，其發(fā)病率高，致殘致死率高。要減輕這一疾病的危害，重點在于預(yù)防。納豆是日本的一種傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品，由蒸煮后的大豆接入枯草芽孢桿菌發(fā)酵而成。納豆激酶（NK）是一種由納豆菌或納豆產(chǎn)生的堿性絲氨酸蛋白酶[1]，具有溶栓作用，與現(xiàn)有的溶栓劑如尿激酶、鏈激酶相比，在體內(nèi)半衰期長，能溫和持續(xù)地提高血液的纖溶活性，同時不易引起出血[2]，因而受到生物醫(yī)學(xué)與食品界的廣泛關(guān)注[2-6]。所以市場上出現(xiàn)了多種納豆激酶保健食品，且都口頭宣稱自己的產(chǎn)品具有良好的溶栓效果。然而，與之相對應(yīng)的納豆激酶溶栓活性的檢測方法卻發(fā)展相對滯后，衛(wèi)生部2003年《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中沒有抗血栓或溶血栓的功能聲稱。因此無法對市場中宣傳具有溶血栓功能的相關(guān)產(chǎn)品進行有效監(jiān)管。角叉菜膠誘導(dǎo)鼠科動物尾部血栓模型制備方法簡單，對實驗操作人員技術(shù)要求不高，在適宜的環(huán)境條件下可以實現(xiàn)較高的造模成功率。造模過程不需要殺害動物，對動物的傷害相對較小。因為血栓出現(xiàn)在尾部，而且血栓的程度易于觀察和測量，適合對血栓形成過程的動態(tài)觀察[7-8]。另外，該模型對象是實驗室小動物，所需費用較少?；谶@些優(yōu)點，該動物模型已經(jīng)在食品的抗血栓功能評價方面得到較為廣泛的應(yīng)用[9-13]。如戎冬梅等[9]對比了飲酒對小鼠尾部血栓形成的影響，各組小鼠于造模后12～48h測量小鼠黑尾長度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量白酒組的小鼠比模型對照組及低劑量白酒組中小鼠的體重低，黑尾也明顯增長，表明隨著酒量的加大，血栓形成的危險增加?？娂t等[12]采用角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾部血栓模型研究黃岑中黃酮類物質(zhì)對血栓形成的影響。實驗組動物灌胃不同劑量的受試物，對照組灌胃等體積蒸餾水，于第5d給受試物1h后制備模型，之后24～72h觀察動物黑尾發(fā)生率及黑尾長度，結(jié)果表明黃芩莖葉明顯降低了小鼠黑尾發(fā)生率。本研究旨在利用角叉菜膠所致小鼠尾部血栓模型，觀察納豆激酶對角叉菜膠所致血栓形成的影響以及其溶栓機制，為納豆激酶相關(guān)產(chǎn)品的抗血栓功能性評價方法的制定提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

實驗動物 SPF級健康雌性昆明種小鼠48只，體重約28g左右，購于北京華阜康生物科技有限公司（許可證號SCXK-（京）2009-0007），飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品功能檢測中心SPF級動物室（許可證號SYXK-（京）2007-0020）；角叉菜膠C1013-25G，Type I，Sigma公司，批次#021M0038V；ELISA試劑盒（FDP、t-PA、PAI） 武漢華美生物工程有限公司；納豆激酶 樣品活力350mg=5000FU，浙江中奇生物藥業(yè)股份有限公司。

游標卡尺，BioTek酶標儀ELx808，Sartorius BS233S分析天平，Anke TDL-5型離心機，恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組與處理 將48只小鼠常規(guī)喂養(yǎng)一周后隨機分為4組：空白組、模型對照組、低劑量組、高劑量組，各12只。各組均采用灌胃途徑，按100μL/10g·bw的灌胃量給藥，喂食30d，其中每7d稱重1次。

表1 分組及其處理方式Table 1 Groups and the treatments

1.2.2 小鼠血栓模型的制備 于第30d開始造模，精密稱取角叉菜膠，以生理鹽水配成0.2g/100mL的質(zhì)量濃度；小鼠稱重后，采取腹腔注射角叉菜膠，注射劑量為100μL/10g·bw。造模后將小鼠置于（17±2）℃的環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲食。

1.2.3 小鼠尾部血栓形成長度的測定 因在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，48h時小鼠尾部血栓部位已經(jīng)開始部分脫落，其黑尾長度已經(jīng)沒有意義，所以選擇在造模24h后，以游標卡尺測量小鼠尾長及黑尾長度。然后，各組小鼠被摘除眼球取血，分離血清，分裝于潔凈離心管中，-20℃冰箱冷藏備用。

1.2.4 小鼠纖溶功能指標的測定 根據(jù)ELISA試劑盒操作說明方法測定血清FDP、t-PA、PAI。測試前將試劑盒和血清置于室溫中至少平衡30min。

ELISA標準曲線通過“Curve Exert1.3”軟件繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 納豆激酶對小鼠體重的影響

由表2可以看出，在30d灌胃期間，各組平均體重一直處于增長狀態(tài)中。其中，低劑量組與高劑量組體重增長相近，均略低于空白組與模型對照組。

在實驗前分組時，各組小鼠間體重?zé)o差異（p＞0.05）。經(jīng)過了30d蒸餾水或納豆激酶灌胃后，各組動物的體重都明顯的增加了（p＜0.05）。在最后一次測量體重時，灌胃納豆激酶的小鼠體重與空白組、模型對照組的體重沒有顯著性差異（p＞0.05），說明納豆激酶不會影響小鼠的正常生長。

表2 實驗前后小鼠體重的變化（±s，n=12）Table 2 The change of mice body weigh（t±s，n=12）

表2 實驗前后小鼠體重的變化（±s，n=12）Table 2 The change of mice body weigh（t±s，n=12）

注：*表示同一組動物實驗前后體重相比較，有顯著性差異（p＜0.05）。

灌胃第30d造模前體重（g）空白組 27.50±1.53 36.60±2.30*模型對照組 28.06±1.14 36.88±2.19*納豆激酶低劑量組 28.00±0.61 34.95±1.67*納豆激酶高劑量組 27.94±0.82 35.17±2.22*組別 開始灌胃前體重（g）

2.2 納豆激酶對小鼠黑尾形成的影響

由表3可知，造模24h后，空白組小鼠黑尾形成率為0，模型對照組黑尾形成率為100%，說明造模成功；低劑量與高劑量組小鼠黑尾形成率均為91.67%，說明灌胃納豆激酶可以一定程度上降低由角叉菜膠所誘導(dǎo)尾部血栓的形成率。模型對照組、低劑量組、高劑量組黑尾長度、黑尾/全尾長的差異無顯著性（p＞0.05），表明灌胃納豆激酶不能降低所出現(xiàn)血栓的程度。

表3 納豆激酶對小鼠黑尾形成的影響（±s，n=12）Table 3 Impact of nattokinase on the forming rate of tail-thrombus in mice（±s，n=12）

表3 納豆激酶對小鼠黑尾形成的影響（±s，n=12）Table 3 Impact of nattokinase on the forming rate of tail-thrombus in mice（±s，n=12）

組別 黑尾長度（cm） 黑尾/全尾長 黑尾形成率（%）空白組 0 0 0模型對照組 3.42±1.66 0.33±0.16 100%低劑量組 3.38±2.34 0.33±0.23 91.67%高劑量組 3.49±1.91 0.34±0.19 91.67%

2.3 納豆激酶對小鼠體內(nèi)纖溶功能的影響

表4中為納豆激酶對小鼠纖溶系統(tǒng)功能幾項指標的影響，如表4所示，模型對照組及納豆激酶低、高劑量組中FDP的含量均比空白組顯著增加（p＜0.05）。FDP是綜合反映纖溶亢進的指標，既包括纖溶酶降解纖維蛋白之后的產(chǎn)物（FDP），也包括降解纖維蛋白原之后的產(chǎn)物（FiDP）。模型對照組小鼠血清中的FDP含量顯著高于空白組（p＜0.05），說明血栓造模后小鼠體內(nèi)自身的纖溶系統(tǒng)啟動，所生成的纖維蛋白原降解產(chǎn)物增多；高劑量組顯著高于模型對照組（p＜0.05），表明高劑量的納豆激酶能夠增強小鼠纖溶系統(tǒng)的功能；而低劑量組與模型空白的FDP值之間沒有顯著性差異（p＞0.05），低劑量納豆激酶沒有起到增強小鼠纖溶系統(tǒng)功能的作用；高劑量組小鼠血清中的FDP含量顯著高于低劑量組（p＜0.05），表明納豆激酶增強小鼠纖溶系統(tǒng)活性的能力存在量效關(guān)系。

表4 納豆激酶對小鼠纖溶系統(tǒng)功能指標的影響（±s，n=12）Table 4 Impact of nattokinase on serum FDP、t-PA、PAI-1 of mice（±s，n=12）

表4 納豆激酶對小鼠纖溶系統(tǒng)功能指標的影響（±s，n=12）Table 4 Impact of nattokinase on serum FDP、t-PA、PAI-1 of mice（±s，n=12）

注：nd：表示沒有未檢出；*表示與空白組相比較有顯著性差異（p＜0.05）；▲表示與模型對照組及低劑量組相比較有顯著性差異（p＜0.05）。

組別 FDP（μg/L） t-PA（μg/L） PAI-1（μg/L）空白組 7.03±2.44 1.78±0.25 nd模型對照組 12.28±3.16* 23.25±1.84* 3.33±0.98低劑量組 10.84±4.46* 24.62±3.07* 3.22±1.12高劑量組 16.12±2.17*▲ 30.11±4.24*▲ 2.87±0.52

t-PA與PAI-1分別是組織型纖溶酶原激活劑與抑制劑。在正常情況下，纖溶酶以酶原的形式存在，只有在t-PA的作用下，才能轉(zhuǎn)化為有活性的纖溶酶。PAI在纖溶過程中起著重要作用，PAI-1是t-PA主要的抑制劑，二者含量的變化對血漿促凝和抗凝的功能狀態(tài)有影響。如表4所示，造模后各處理組小鼠血清t-PA值都顯著高于空白組（p＜0.05）；同時高劑量組中t-PA含量明顯高于模型對照組與低劑量組（p＜0.05），說明喂食高劑量納豆激酶可以顯著增加小鼠血清t-PA的含量，且存在一定的量效關(guān)系?？瞻捉M中沒有檢測出PAI-1，因為小鼠在正常狀態(tài)t-PA與PAI-1保持一定的比例關(guān)系，在前者含量很低的情況下，后者的含量也很低，所以沒有檢測到PAI-1。而其他各組中均檢測出含有PAI-1，高劑量組中PAI-1的值較模型對照組及低劑量組低，但各組之間不存在顯著性差異（p＞0.05），表明喂食納豆激酶對PAI-1的含量沒有明顯影響。

3 討論

自從1987年日本的Sumi H等人發(fā)現(xiàn)納豆中存在可以溶解血栓纖維蛋白的成分-納豆激酶以后[14]，已經(jīng)有很多學(xué)者對納豆激酶的結(jié)構(gòu)、藥理學(xué)以及藥效等方面進行了研究，發(fā)現(xiàn)其具有多方面保健作用，但其纖溶作用比較突出，該方面的研究居多。

段智變等[15]通過20%FeCl3制備兔頸動脈血栓模型，并利用日本大耳兔觀察納豆激酶粗酶液的體內(nèi)溶血栓作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高劑量組給藥2h后，F(xiàn)DP含量明顯增高；張利[16]用電刺激血栓形成法給藥后制備大鼠頸動脈血栓模型，觀察從血栓形成到動脈血流完全阻斷所需要的時間，對納豆激酶溶血栓作進行研究，發(fā)現(xiàn)納豆激酶均能顯著地延長血流阻斷所需的時間；實驗同時還利用日本大耳兔為實驗動物，采用股動脈富含紅細胞血栓模型，研究了納豆激酶對兔股動脈栓塞的再通作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)空白對照組無一側(cè)股動脈再通，而給予納豆激酶后約40min，兔股動脈平均血流量恢復(fù)50%以上，F(xiàn)DP檢測結(jié)果明顯增高，表明納豆激酶具有較強的體內(nèi)溶栓作用；在對其溶栓機理進行研究時發(fā)現(xiàn)，納豆激酶可顯著提高t-PA的含量及活性，而對PAI-1的含量無明顯影響，表明納豆激酶可以通過激活t-PA來發(fā)揮溶栓作用的，這與本實驗研究結(jié)果相同。毛娜娜[17]利用腎上腺素加冰浴制備大鼠急性血瘀模型，并通過Real Time PCR觀察納豆激酶對大鼠主動脈t-PA、PAI-1基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)納豆激酶可明顯增加t-PA mRNA的表達，但對PAI-1 mRNA的表達無明顯性影響。

本實驗中采用小鼠作為實驗動物，利用簡單的動物模型對納豆激酶的纖溶活性進行了研究。在研究納豆激酶對黑尾形成率的影響時發(fā)現(xiàn)，灌胃一定劑量的納豆激酶可以起到降低黑尾發(fā)生率也即血栓發(fā)病率的作用。同時，對其纖溶機制進行研究的結(jié)果表明，喂食高劑量的納豆激酶能夠提高t-PA的值，對PAI-1沒有顯著影響，F(xiàn)DP含量有顯著增加。

4 結(jié)論

納豆激酶對實驗小鼠體內(nèi)血栓具有溶解作用從而起到預(yù)防血栓發(fā)生的效果，能夠降低血栓的發(fā)病率；角叉菜膠誘導(dǎo)的小鼠血栓模型可以用于納豆激酶溶（抗）血栓功能評價，通過黑尾的發(fā)生率進行初步判斷，同時對其纖溶功能的生化指標如FDP、t-PA、PAI-1的檢測值進行進一步確認。

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Impact of nattokinase on carrageenan induced tail-thrombus mice

LIU Yan-xia，CHEN Wen，WEN Zong-yan，ZHAO Xiao-meng
（Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods，College of Arts and Science，Beijing Union University，Beijing 100191，China）

TS201.4

A

1002-0306（2012）20-0330-04

2012－07－19

劉彥霞（1976－），女，博士，助理研究員，研究方向：保健食品功能評價研究。

北京市教委科技計劃面上項目（KM201211417005）；北京聯(lián)合大學(xué)人才強校計劃人才資助項目。