姚盟成，楊麗萍，司建華，荊 瑋，路福平，李 玉，*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.云南健生生物科技有限公司，云南昆明 650217）

果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化及其性質(zhì)研究

姚盟成1，楊麗萍2，司建華2，荊 瑋1，路福平1，李 玉1，*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.云南健生生物科技有限公司，云南昆明 650217）

果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化可以很方便地實(shí)現(xiàn)酶的回收和再利用。以HPA25L樹脂為固定化載體，對果糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行了固定化初步研究。結(jié)果表明，其最優(yōu)固定化條件為：采用先交聯(lián)后固定化方法，以戊二醛為交聯(lián)劑，固定化溫度20℃，pH5.0，加酶量10mL/g樹脂，戊二醛濃度為0.15%，得到固定化酶酶活達(dá)120U/g，酶活回收率達(dá)81%，其最適反應(yīng)溫度和pH分別為55℃和7.0，利用固定化酶連續(xù)反應(yīng)12個(gè)批次后，酶活仍然保留達(dá)20%以上。

果糖基轉(zhuǎn)移酶，固定化酶，低聚果糖，HPA25L樹脂

Abstract：To recycle easily and reuse fructosyltransferase for producing fructooligosacchari-des with its excellent catalytic properties，fructosyltransferase was immobilized on resin of HPA25L.The optimum operation parameter was examined，and the optimum conditions for the immobilization were obtained as follows：glutaraldehyde 0.15%，temperature 20℃，pH5.0 and fructosyltransferase 10mL/g（resin）.Under these conditions，the total recovery percentage of the immobilized enzyme specific activity was above 81%.And the optimum operation pH and temperature of immobilized enzyme were 55℃ and 7.0 respectively.After 12 times reused，the activity of immobilized enzyme retained more than 20%.

Key words：fructosyltransferase；immobilization enzyme；fructooligosaccharides；resin of HPA 25L

低聚果糖（Fructooligosaccharides，簡稱FOS），又稱寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式為：G-F-Fn，n=1～3（G為葡萄糖，F(xiàn)為果糖）。低聚果糖是蔗糖分子的果糖殘基上通過β-1-2糖苷鍵連接1～3個(gè)果糖基而形成的果糖寡聚體：蔗果三糖（1-kestose，GF2）、蔗果四糖（nystose，GF3）、蔗果五糖（1F-fructofuranosyl nystose，GF4）及其混合物[1]。與傳統(tǒng)糖類相比，新型低聚果糖可作為益生元，促進(jìn)雙歧桿菌的生長、減少有害菌；低聚果糖具有水溶性膳食纖維的功效，且無任何毒副作用。低聚果糖還具有可促進(jìn)礦物質(zhì)的吸收、增強(qiáng)身體的免疫功能、抗癌、降血糖以及防齲齒等功能[2-3]。低聚果糖廣泛的存在于大麥、西紅柿、黑麥等植物當(dāng)中，但其含量較少，低于1%，開發(fā)較難。而利用微生物的低聚果糖生產(chǎn)酶果糖基轉(zhuǎn)移酶卻可以得到高純度、高產(chǎn)量的低聚果糖。果糖基轉(zhuǎn)移酶（fructosyltransferase，EC2.4.1.9），是一種具有果糖基轉(zhuǎn)移活性的酶，能作用于蔗糖而得到蔗果三糖等低聚糖。因此，人們越來越關(guān)注果糖基轉(zhuǎn)移酶及低聚果糖生產(chǎn)，目前國內(nèi)利用果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)低聚果糖一般采用游離酶直接作用于蔗糖，此法有游離酶只能利用一次、生產(chǎn)成本高、產(chǎn)物收率不高等缺點(diǎn)，而固定化酶與游離酶相比，固定化酶極易與底物、產(chǎn)物分開，產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留，提純工藝簡化，能夠在較長時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)（分批反應(yīng)和連續(xù)反應(yīng)），便于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化和自動(dòng)化，能夠提高酶的穩(wěn)定性和利用率，生產(chǎn)成本降低；還可以增加產(chǎn)物的收率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量[4-5]。因此果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化已經(jīng)逐漸成為研究熱點(diǎn)，已報(bào)道的果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化載體有大孔陰離子樹脂、殼聚糖、羥磷灰石等[6-8]。三菱化學(xué)陰離子交換樹脂HPA25L是一種高多孔型陰離子交換樹脂，是一類既不溶于水也不熔于有機(jī)溶劑、且具有三維空間網(wǎng)狀骨架結(jié)構(gòu)親水性的功能高分子材料。利用連接在樹脂骨架上的功能基團(tuán)與酶作用，可將酶固定在樹脂上，構(gòu)成固定化酶，且其價(jià)格低廉、機(jī)械強(qiáng)度好、物化性能穩(wěn)定，容易再生，耐膨脹收縮力強(qiáng)，是一種較為理想的固定化酶載體。本實(shí)驗(yàn)采用高多孔型三菱化學(xué)陰離子交換樹脂（HPA25L）為載體，對其固定化條件及其性質(zhì)進(jìn)行了相關(guān)研究，為果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化研究和低聚果糖生產(chǎn)提供了理論依據(jù)，具有借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉菌絲體 云南健生生物科技公司；陰離子交換樹脂HPA25L 上海三菱化學(xué)商貿(mào)有限公司；戊二醛 中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司。

Agilent1200液相色譜系統(tǒng) 美國Agilent公司；WE-3恒溫水浴振蕩器 天津歐諾儀器儀表有限公司；DW3冷凍干燥機(jī) 丹麥Heto公司；高速冷凍離心機(jī) Beckman公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樹脂的預(yù)處理 稱取10g樹脂在10%NaCl溶液中浸泡1h（質(zhì)量體積比為1∶5），然后用蒸餾水將樹脂清洗干凈，再用同樣5倍體積的蒸餾水浸泡10h。將樹脂置于5倍體積的1mol/L NaOH溶液中1～2h，并不時(shí)攪拌，然后用蒸餾水洗滌樹脂，水洗至中性，再置于5倍體積的1mol/L HCl溶液中1～2h，不時(shí)攪拌，然后水洗至中性，重復(fù)“堿-水-酸-水”三個(gè)循環(huán)，最后將樹脂置于0.01mol/L pH7.0磷酸緩沖液中4℃保存?zhèn)溆肹9-10]。

1.2.2 游離果糖基轉(zhuǎn)移酶的提取 在黑曲霉菌絲中加入5倍體積的水，球磨機(jī)5000r/min條件下20min，球磨兩次，然后在超高壓均質(zhì)機(jī)1000bar條件下破壁兩次，冷凍離心，超濾濃縮得到粗酶液，再冷凍干燥至粉末，放置4℃冰箱長期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 固定化方法

1.2.3.1 先交聯(lián)后固定 稱取適量的樹脂，將其置于5倍體積的0.01mol/L pH7.0磷酸緩沖液中，加入適量50%戊二醛，交聯(lián)作用8h，之后用蒸餾水清洗三次，洗去多余戊二醛。

將處理好的酶液相對樹脂按5倍體積的量加入反應(yīng)容器中，固定化作用18h，之后用蒸餾水清洗三次，分別測定固定化酶酶活和固定化酶酶活回收率。

1.2.3.2 交聯(lián)與固定同步 稱取適量的樹脂，將其置于5倍體積的酶液中，加入適量50%戊二醛，置于恒溫條件下作用24h，之后用蒸餾水清洗三次，分別測定固定化酶酶活和固定化酶酶活回收率。

1.2.3.3 先固定后交聯(lián) 稱取適量的樹脂，將其置于5倍體積的酶液中，反應(yīng)18h，之后分別用蒸餾水清洗三次，洗去多余游離酶。然后加入適量50%戊二醛，交聯(lián)8h，之后用蒸餾水清洗三次，洗去多余的戊二醛，分別測定固定化酶酶活和固定化酶酶活回收率。

1.2.4 果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活測定 取16mL 12.5%的蔗糖溶液和4mL pH5.0的0.05mol/L檸檬酸-磷酸緩沖液倒入三角瓶中。加入適量游離酶液或者固定化酶，在50℃溫度下，200r/min的恒溫回旋式搖床中反應(yīng)60min，取出后于沸水浴中煮沸10min終止反應(yīng)，冷至室溫，于10000r/min臺(tái)式離心機(jī)上離心2min，取上層清液，作為HPLC法測定蔗果三糖含量的試液，并計(jì)算出酶活及相對酶活。

1.2.5 果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活定義 果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活定義為：在上述反應(yīng)條件下，每1min產(chǎn)生1μmol GF2所需的酶量為1個(gè)活力單位，固定化酶活測定方法同游離果糖基轉(zhuǎn)移酶活的測定方法[11]。固定化酶活回收率：固定化酶活與所添加的游離酶總酶活的比值。

1.2.6 固定化酶酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.6.1 固定化酶酶的最適反應(yīng)溫度和pH 分別將固定化酶和游離酶保存在40、45、50、55、60、65、70℃溫度下1h，然后分別測定其酶活，計(jì)算其相對酶活；分別將固定化酶和游離酶保存在pH為4、5、6、7、8緩沖液中1h，然后分別測定其酶活，計(jì)算其相對酶活。

1.2.6.2 固定化酶酶的操作穩(wěn)定 利用固定化酶轉(zhuǎn)化50%的蔗糖生成低聚果糖，低聚果糖的含量達(dá)到50%以上算一個(gè)批次，每反應(yīng)一個(gè)批次測一次殘余酶活，然后再重新加入底物，進(jìn)行下一批次反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化條件優(yōu)化

2.1.1 不同固定化方法對酶的固定化的影響 本實(shí)驗(yàn)先后采取了先交聯(lián)后固定、交聯(lián)固定同步以及先固定后交聯(lián)的方式進(jìn)行固定化研究，固定化溫度4℃，戊二醛濃度為0.1%，固定化pH為6.0，加酶量為5倍體積的條件下，交聯(lián)6h，固定12h，交聯(lián)固定同步進(jìn)行固定化6h。其結(jié)果如表1所示，酶活分別是95、80.5、10.3U/g，酶活回收率分別為75%、63.5%、8.1%。結(jié)果表明，先加交聯(lián)劑戊二醛后固定化的效果最好，固定化酶活95U/g最高，酶活回收率75%也最高。所以我們將采取先交聯(lián)后固定的方式進(jìn)行果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化。

表1 不同固定化方法對固定化的影響Table 1 Effect of method of immobilization on activity of immobilized enzyme

2.1.2 不同溫度對酶的固定化的影響 采用先交聯(lián)后固定的固定化方法，在戊二醛濃度為0.1%、pH為6.0、加酶量為5倍體積的條件下，研究不同的溫度對酶的固定化的影響，其結(jié)果如圖1所示，低溫有利于酶的穩(wěn)定，但是吸附交聯(lián)需要一定的溫度。4～20℃溫度下，隨著溫度的上升，固定化效果有一定提高，但到了20℃時(shí)，固定化酶活有了較大輻度的下降，溫度越高不利于酶的穩(wěn)定，因此酶的固定化最適溫度為20℃。

圖1 不同溫度對固定化的影響Fig.1 Effect of temperature on activity of immobilized enzyme

2.1.3 不同pH對酶的固定化的影響 采用先交聯(lián)后固定的固定化方法，在戊二醛濃度為0.1%、固定化溫度20℃、加酶量為5倍體積的條件下，選用不同pH條件下進(jìn)行酶的固定化研究。pH對酶的穩(wěn)定性具有十分重要的影響，pH過高或者過低都對酶的穩(wěn)定產(chǎn)生較大的影響，圖2表明，酶固定化的最適pH是5.0，在此條件下，酶的穩(wěn)定性好，有利于游離酶的吸附交聯(lián)，從而有利于游離酶的固定化，因而其最適固定化pH為5.0。

圖2 不同pH對固定化的影響Fig.2 Effect of pH on activity of immobilized enzyme

2.1.4 不同加酶量對酶的固定化的影響 采用先交聯(lián)后固定的固定化方法，在戊二醛濃度為0.1%、固定化溫度20℃、固定化pH5.0的條件下，研究不同的加酶量對酶固定化的影響，其結(jié)果如圖3所示。隨著酶液量加大，固定化酶活逐漸升高，但是其酶活損失卻相對增加，即酶活回收率降低，這是由于在離子交換樹脂的活性基團(tuán)未被酶交聯(lián)飽和前，固定化酶活將隨著加酶量的增加而增強(qiáng)，在活性基團(tuán)被酶交聯(lián)飽和后，固定化酶的活力不再隨加酶量的增加而明顯增加，甚至當(dāng)加酶量達(dá)到一定程度時(shí)，會(huì)因?yàn)榻Y(jié)合的酶分子過多而造成酶作用的空間位阻加大，使酶活性增加緩慢，酶活損失加大。因此，綜合考慮固定化酶活和酶活損失，最適加酶量為10倍體積（每1g樹脂加10mL體積酶液）。

圖3 不同酶量對固定化的影響Fig.3 Effect of amount of enzyme on activity of immobilized enzyme

2.1.5 戊二醛的濃度對酶的固定化的影響 采用先交聯(lián)后固定的固定化方法，在加酶量為10倍體積、固定化溫度20℃、固定化pH5.0的條件下，研究不同濃度的戊二醛對酶的固定化的影響，其結(jié)果如圖4所示。戊二醛是一種交聯(lián)劑，但也是一種使酶變性的試劑。在一定濃度范圍內(nèi)，提高戊二醛濃度可以提高固定化效果，但是超過一定濃度時(shí)，戊二醛將會(huì)使酶變性失活，影響固定化酶的效果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：戊二醛濃度小于0.15%時(shí)候，固定化酶活隨著戊二醛濃度增加而增加，當(dāng)戊二醛濃度大于0.15%后，固定化酶活將會(huì)降低，說明當(dāng)戊二醛濃度是0.15%時(shí)，固定化效果最好，因此，戊二醛濃度為0.15%是固定化交聯(lián)劑的最適濃度。此時(shí)利用最優(yōu)條件得到固定化酶酶活達(dá)120U/g，此次所用初始酶液酶活為148.1U/mL，酶活回收率達(dá)81%。

圖4 不同戊二醛濃度對固定化的影響Fig.4 Effect of glutaraldehyde concentration on activity of immobilized enzyme

2.2 固定化酶酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 固定化酶的最適pH和最適反應(yīng)溫度 由圖5可以看出，游離酶的最適溫度為50℃，而固定化酶的最適溫度為55℃。因此果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化后最適溫度升高，并且在70℃時(shí)，游離酶沒有酶活，而固定化酶酶活達(dá)60%以上，這可能是由于載體的保護(hù)作用，使酶在固定化后對熱變性作用不敏感，熱穩(wěn)定性增加。由圖6可以看出，游離酶和固定化酶的最適反應(yīng)pH分別為6.0和7.0，這是由于吸附、交聯(lián)等作用，固定化材料大孔陰離子樹脂與酶蛋白基團(tuán)上的化學(xué)鍵發(fā)生了作用，影響到了酶的活性部位，從而使固定化酶的最適反應(yīng)pH增加了一個(gè)單位。

圖5 固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)溫度Fig.5 Optimum temperature of immobilized and soluble enzyme

圖6 固定化酶和游離酶的最適反應(yīng)pHFig.6 Optimum pH of immobilized and soluble enzyme

2.2.2 固定化酶的操作穩(wěn)定性 利用固定化酶催化蔗糖轉(zhuǎn)化為50%以上純度的低聚果糖，結(jié)果如圖7所示，固定化酶連續(xù)反應(yīng)12個(gè)批次后，固定化酶酶活仍然保持20%以上，說明固定化酶具有較好的操作穩(wěn)定性。而馬玉紅利用D380作為固定化載體固定果糖基轉(zhuǎn)移酶重復(fù)使用10次后殘余酶活僅為10%左右[12]。

圖7 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig.7 Operation stability of immobilized enzyme

3 結(jié)論

以HPA25L為載體進(jìn)行果糖基轉(zhuǎn)移酶的固定化，其最優(yōu)條件是：加酶量為10倍體積于樹脂（酶液體積與樹脂的質(zhì)量之比），在20℃、pH5.0的條件下先交聯(lián)后固定，加酶量10mL/g樹脂以濃度為0.15%的戊二醛為交聯(lián)劑，獲得的果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化酶，其酶活120U/g，酶活回收率為81%，固定化酶最適反應(yīng)溫度和pH分別為55℃和7.0。利用固定化酶生產(chǎn)低聚果糖，連續(xù)反應(yīng)12批次后，固定化酶酶活仍然保持20%以上。利用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)低聚果糖，是低聚果糖工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的一個(gè)突破點(diǎn)，具有十分巨大的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

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Research of preparation and properties of immobilized fructosyltransferase

YAO Meng-cheng1，YANG Li-ping2，SI Jian-hua2，JING Wei1，LU Fu-ping1，LI Yu1，*
（1.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；2.Yunnan Jiansheng Biological Technology Co.，Ltd.，Kunming 650217，China）

TS201.3

A

1002-0306（2012）20-0164-04

2012-04-05 *通訊聯(lián)系人

姚盟成（1987-），男，在讀碩士，研究方向：酶工程。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題（2011AA100905-4）；天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（10ZCKFNC01700）；長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃資助（IRT1166）。