郭正霞，孫兆敏，張 芹，王靜鳳，薛長湖

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

酶法催化乙酯甘油酯酯交換制備富含EPA和DHA的甘油酯

郭正霞，孫兆敏，張 芹，王靜鳳，薛長湖*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

采用國產(chǎn)固定化假絲酵母脂肪酶，催化乙酯型和甘油酯型魚油酯交換制備富含EPA和DHA的甘油酯型魚油，得到EPA和DHA總量超過45%的甘油酯。以5g甘油酯型魚油為反應(yīng)底物之一，考察了反應(yīng)溫度、時間、酶加量、底物質(zhì)量比及加水量五個因素對酯交換反應(yīng)的影響，利用正交實驗優(yōu)化，得到最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間24h，底物質(zhì)量比為5∶4，加酶量為80U，不向反應(yīng)體系中加入水分。在該條件下得到的甘油酯中EPA和DHA的含量分別為33.40%和13.10%，并且脂肪酶重復(fù)利用7次仍能達到工藝目標。

無溶劑體系，假絲酵母脂肪酶，n-3多不飽和脂肪酸，酯-酯交換

Abstract：The immobilized Candida sp.lipase was used as the catalyst of transesterification to prepare glycerides which contained 45%DHA and EPA totally.Transesterification was carried out with fish oil ethyl esters and triglycerides as substrates.The effect on transesterification of temperature，reaction time，enzyme dosage，substrate weight ratio and water dosage were investigated with 5g glycerides as one of the substrates.The favorable conditions obtained were：reaction temperature 60℃，reaction time 24h，the substrate weight ratio 5∶4，enzyme dosage 80U，without adding water to the reaction system.Under these conditions，the glycerides obtained contained 33.40%EPA and 13.10%DHA，and the immobilized enzyme could be used for seven times.

Key words：solvent free system；Candida sp.lipase；n-3 polyunsaturated fatty acid；transesterification

魚油中含有的n-3多不飽和脂肪酸（n-3 PUFA），尤其是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）在人體營養(yǎng)健康方面具有重要作用。甘油酯型是魚油的天然存在形式，但n-3 PUFA相對含量比較低（多在30%以下）。為了提高EPA和DHA的含量，人們多采用化學方法獲得含有脂肪酸的乙醇酯，然后經(jīng)過尿素包合和分子蒸餾制備得到富含EPA和DHA的乙酯型魚油產(chǎn)品。但Lawson Larry等[1]和Ikeda Ikuo等[2]的研究結(jié)果表明，乙酯型魚油在人體中的消化和吸收較困難，并且可能存在安全隱患。自上世紀九十年代至今，利用脂肪酶制備富含EPA和DHA的甘油酯是眾多研究者關(guān)注的課題。目前制備富含n-3 PUFA甘油酯的方法有水解法[3-6]、酯交換法[7-10]和酯合成法[11-14]三類。其中水解法所需的具有嚴格1，3-位特異性的脂肪酶比較少，效率和得率都比較低，在脂肪酶將飽和脂肪酸和低不飽和脂肪酸從甘油骨架水解下來的同時，也會有大量EPA和DHA被水解下來，且水解法采用的油-水體系不利于脂肪酶的重復(fù)利用；酯合成法所采用的反應(yīng)底物為甘油和游離脂肪酸，采用的脂肪酶多為諾維信公司生產(chǎn)的Novozym 435，Novozym 435價格較為昂貴，且存在甘油和脂肪酸的良好混合以及提高甘油三酯的得率等問題；酯交換法包括醇解法、酸解法和酯-酯交換法，本研究在無溶劑體系中采用脂肪酶催化乙酯型和甘油酯型的酯-酯交換反應(yīng)，制備EPA和DHA總含量超過45%的甘油酯型魚油。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乙酯型魚油 河北海源康健生物科技有限公司，EPA 43.5%、DHA 32.7%；甘油三酯型魚油 浙江萬聯(lián)藥業(yè)公司，EPA 21.9%、DHA 6.96%；假絲酵母脂肪酶 北京凱泰新世紀生物技術(shù)有限公司；正己烷、乙醚、乙酸、石油醚 天津博迪化工股份有限公司，分析純。

6890N氣相色譜儀 配有FID檢測器，美國Agilent公司；INNOWax毛細管色譜 30m×0.32mm×0.25μm，美國Agilent公司；SHA-B水浴搖床 常州國華儀器公司。

1.2 無溶劑體系脂肪酶酯-酯交換活力的測定

分別稱取5.0g三油酸甘油酯與正辛酸乙酯于25mL具塞三角瓶中，加入0.05g固定化脂肪酶，充氮密封后于60℃水浴搖床中振蕩反應(yīng)2h。氣相色譜測定甘油酯中正辛酸含量，定義在該條件下每分鐘將1μmol正辛酸轉(zhuǎn)移到三油酸甘油酯所需的酶量為1個酯-酯交換酶活單位。

1.3 酯-酯交換反應(yīng)

分別稱取一定量甘油三酯型魚油和乙酯型魚油以及固定化脂肪酶，置于50mL具塞錐形瓶中，氮氣吹掃后，立即用玻璃塞封口并固定，置于水浴搖床中振蕩反應(yīng)，進行單因素實驗：

1.3.1 考察溫度對酯-酯交換反應(yīng)的影響 在反應(yīng)時間24h、底物質(zhì)量比為1∶1、甘油三酯質(zhì)量為5g、固定化脂肪酶添加量為80U的條件下，選取了40、45、50、55、60、65、70℃六個數(shù)據(jù)點來考查溫度因素對酯交換反應(yīng)的影響。

1.3.2 考察反應(yīng)時間對酯-酯交換反應(yīng)的影響 在反應(yīng)溫度60℃、底物質(zhì)量比為1∶1、甘油三酯質(zhì)量為5g、脂肪酶添加量為80U的條件下，選取了6、12、18、24、36、48、60h七個數(shù)據(jù)點來考察反應(yīng)時間對酯交換反應(yīng)的影響。

1.3.3 考察脂肪酶添量對酯-酯交換反應(yīng)的影響 在反應(yīng)溫度60℃、底物質(zhì)量比為1∶1、甘油三酯質(zhì)量為5g、反應(yīng)時間為24h的條件下，選取了40、80、120、160、200U五個數(shù)據(jù)點來考查加酶量對酯交換反應(yīng)的影響。

1.3.4 考察底物質(zhì)量比對酯-酯交換反應(yīng)的影響 在反應(yīng)溫度60℃、反應(yīng)時間為24h、甘油三酯質(zhì)量為5g、脂肪酶添加量為80U的條件下，選取了甘油三酯與乙酯的質(zhì)量比為2∶1、1∶1、2∶3、1∶2、2∶5、1∶3六個數(shù)據(jù)點來考查底物質(zhì)量比對酯交換反應(yīng)的影響。

1.3.5 考察加水量對酯-酯交換反應(yīng)的影響 在反應(yīng)溫度60℃、反應(yīng)時間24h，底物質(zhì)量比為1∶1、甘油三酯質(zhì)量為5g、脂肪酶添加量為80U的條件下，選取了0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、8.0%五個數(shù)據(jù)點來考查加水量對酯交換反應(yīng)的影響。

1.4 正交實驗

根據(jù)1.3中單因素結(jié)果設(shè)計正交實驗，正交實驗因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Values and code symbols of orthogonal experiment

1.5 脂肪酶的重復(fù)利用

在1.4確定的較優(yōu)條件下反應(yīng)，反應(yīng)完畢后靜置使酶沉淀于瓶底，倒出瓶中的混合油脂，再向具塞錐形瓶中加入底物，氮氣吹掃后密封，置于水浴搖床中進行后續(xù)反應(yīng)。

1.6 氣相色譜法測定甘油酯中EPA和DHA含量

將反應(yīng)后的混合魚油10μL點樣于5×10cm TLC硅膠預(yù)制板上，在正己烷-乙醚-乙酸（85∶15∶1，V∶V∶V）中展開，碘缸中略微顯色，刮下甘油酯點于10mL試管中，甲酯化后氣相色譜分析其脂肪酸組成。

氣相色譜條件：色譜柱：INNOWax石英毛細管柱（30m×0.32mm×0.25μm）；進樣口溫度240℃，分流比25∶1，進樣量1μL；升溫程序：起始溫度170℃，以3℃/min升至210℃，保持24min；載氣（高純氮氣）流速1mL/min；FID檢測器參數(shù)：檢測器溫度250℃，氫氣流速40mL/min，空氣流速450mL/min，尾吹氣（氮氣）流速40mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 反應(yīng)溫度對酯交換反應(yīng)的影響 由圖1可知，隨反應(yīng)溫度的提高，所得甘油三酯中EPA和DHA的總含量緩慢提高，當溫度為55℃時，經(jīng)過24h反應(yīng)，甘油酯中EPA和DHA的總含量已經(jīng)能夠達到45.01%，當溫度升高到65℃時總含量達到最高，繼續(xù)升高溫度則EPA和DHA的總含量有所下降。在實驗所選的溫度范圍（40～70℃）內(nèi)，隨溫度的提高，酶的活力提高，該無溶劑體系的粘度系數(shù)下降，利于反應(yīng)底物和反應(yīng)產(chǎn)物的擴散，因此得到的甘油酯中EPA和DHA的總含量提高，繼續(xù)升高溫度則容易導致固定化酶的不可逆失活，加劇不飽和脂肪酸的氧化。

圖1 反應(yīng)溫度對魚油甘油三酯和乙酯酯交換的影響Fig.1 The effect of reaction temperature on transesterification between triglycerides and ethyl esters

2.1.2 反應(yīng)時間對酯交換反應(yīng)的影響 由圖2可知，在反應(yīng)的初期，由于底物濃度較高，反應(yīng)速度較快，在反應(yīng)的前6h，甘油三酯中的EPA和DHA的總含量由28.9%提高到36.06%，之后的6h反應(yīng)速度有所減緩，由36.06%提高到40.21%。當反應(yīng)至24h時，產(chǎn)物甘油酯中EPA和DHA的總含量已經(jīng)達到46.03%，此時反應(yīng)基本達到平衡，繼續(xù)延長反應(yīng)時間至60h，EPA和DHA的含量緩慢提高到49.11%。

圖2 反應(yīng)時間對魚油甘油三酯和乙酯酯交換反應(yīng)的影響Fig.2 The effect of reaction time on transesterification between triglycerides and ethyl esters

圖3 加酶量對魚油甘油三酯和乙酯酯交換的影響Fig.3 The effect of enzyme dosage on transesterification between triglycerides and ethyl esters

2.1.3 加酶量對酯交換反應(yīng)的影響 由圖3可知，當反應(yīng)體系中加入40U脂肪酶時，經(jīng)過24h酯交換反應(yīng)后，得到EPA和DHA的總含量為41.33%的甘油三酯；脂肪酶量增加一倍，得到的甘油酯中EPA和DHA的總含量可達到46.12%，繼續(xù)增加脂肪酶的用量可使EPA和DHA的總含量達到47%以上，但當脂肪酶添加量為160U時反應(yīng)達到平衡，繼續(xù)增大脂肪酶量無助于甘油酯中EPA和DHA含量的提高。

2.1.4 底物質(zhì)量比對酯交換反應(yīng)的影響 由圖4可知，當?shù)孜镔|(zhì)量比為2∶1時，經(jīng)過24h的酯交換反應(yīng)，魚油甘油三酯中EPA和DHA的總含量為36.53%，底物質(zhì)量比為1∶1時提高到46.07%，乙酯型魚油對甘油三酯的比例從1∶1增加到3∶1的過程中，產(chǎn)物甘油三酯中EPA和DHA的總含量緩慢增加。

圖4 底物質(zhì)量比對魚油甘油三酯和乙酯酯交換反應(yīng)的影響Fig.4 The effect of substrate ratio on transesterification between triglycerides and ethyl esters

從圖4中的實驗結(jié)果可以看出，底物中乙酯比例的提高，有利于富集DHA和EPA于甘油三酯中。應(yīng)該可以推測出，加大乙酯魚油的比例，可以在實現(xiàn)工藝目標的同時，減少反應(yīng)時間，避免脂肪酶長時間處在較高溫度下，利于脂肪酶的穩(wěn)定，但乙酯比例的提高也伴隨著后期分離成本的提高，所以最高只考察了3∶1的配比。

2.1.5 加水量對酯交換反應(yīng)的影響 由圖5可知，當反應(yīng)體系中不添加水分時，在所述的反應(yīng)條件下得到甘油酯中EPA和DHA的總含量在45%以上，加入0.5%（占底物總質(zhì)量）水后，EPA和DHA的總含量下降到39.73%，繼續(xù)加大水量則EPA和DHA的含量繼續(xù)降低，反應(yīng)體系中甘油二酯和單甘油酯的含量明顯增加，當加水量達到5%后，繼續(xù)加大水量至8%，得到甘油酯中EPA和DHA的總含量變化不大。

圖5 加水量對魚油甘油三酯和乙酯酯交換反應(yīng)的影響Fig.5 The effect of water dosage on transesterification between triglycerides and ethyl esters

在一定范圍內(nèi)，脂肪酶含水量越高，其對熱的穩(wěn)定性越低，由于水的加入，導致脂肪酶含水量增加，其在反應(yīng)體系中的穩(wěn)定性降低，不利于脂肪酶的重復(fù)利用。不僅如此，水量的增加，利于水解反應(yīng)的進行，一方面甘油三酯被水解導致其得率降低，另一方面乙酯被水解之后產(chǎn)生乙醇和脂肪酸，乙醇在反應(yīng)體系中的出現(xiàn)會導致部分脂肪酶的失活。

2.2 正交實驗

根據(jù)2.1中單因素實驗所得實驗結(jié)果，設(shè)計四因素三水平正交實驗，實驗結(jié)果如表2所示。

表2 正交實驗結(jié)果及分析Table 2 Results and analysis of the orthogonal experiment

根據(jù)表2中的R值可知，在所選的因素水平范圍內(nèi)，對酯交換結(jié)果影響最大的是反應(yīng)時間，其次是加酶量，反應(yīng)影響最小的是底物質(zhì)量比。其中最優(yōu)條件為A3B3C1D2，即反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)時間24h，底物質(zhì)量比為5∶4，加酶量為80U，在該條件下得到的甘油酯中EPA和DHA的含量分別為33.40%和13.10%。

2.3 脂肪酶的重復(fù)利用

目前，脂肪酶昂貴的價格是制約其在油脂工業(yè)應(yīng)用的重要因素。為了降低工藝成本，除了篩選較為廉價的脂肪酶，還應(yīng)當從脂肪酶的重復(fù)利用入手。工藝條件中的反應(yīng)體系、溫度、時間、水分含量、反應(yīng)底物及產(chǎn)物等都會影響脂肪酶的穩(wěn)定性，另外，脂肪酶的固定化方式也會影響脂肪酶的利用次數(shù)。

在較優(yōu)條件，即反應(yīng)溫度60℃、反應(yīng)時間24h、底物質(zhì)量比為5∶4、加酶量為80U的條件下，重復(fù)利用脂肪酶催化酯交換反應(yīng)。由圖6可知，當重復(fù)利用脂肪酶至第七次時，仍能實現(xiàn)工藝目標，催化第八次反應(yīng)得到的甘油酯中EPA和DHA含量為44.76%，第九次為43.32%，因此在連續(xù)反應(yīng)的過程中，需要在第七次反應(yīng)后適當補加脂肪酶才能保證達到工藝目標。

實驗采用的國產(chǎn)脂肪酶雖然較進口脂肪酶廉價，但在較優(yōu)的工藝條件下，可重復(fù)利用并達到工藝目標的次數(shù)較少，可能與反應(yīng)溫度和時間有關(guān)。通過進一步優(yōu)化工藝條件，尤其是降低反應(yīng)溫度，縮短反應(yīng)時間，可能會提高脂肪酶的利用次數(shù)；另外，由于該國產(chǎn)固定化脂肪酶采用的固定化載體為無紡布（需將整塊酶布剪碎使用），在振蕩反應(yīng)過程中脂肪酶極易脫落；同時，改變固定化酶的載體（如大孔吸附樹脂），也可能會提高固定化酶的重復(fù)利用次數(shù)。

圖6 脂肪酶的重復(fù)利用Fig.6 The reutilization of lipase

2.4 脂肪酸組成分析

由表3可看出，在較優(yōu)條件下反應(yīng)，反應(yīng)后魚油甘油酯中EPA含量由21.91%增長為32.40%，DHA含量由6.96%增長到13.10%；反應(yīng)后魚油乙酯中EPA含量由43.5%降低為35.45%，DHA含量由32.7%降低至20.39%。經(jīng)24h酯交換反應(yīng)后，原魚油甘油三酯中的少量長鏈飽和脂肪酸如豆蔻酸、硬脂酸等也通過酯交換反應(yīng)形成乙酯。對于反應(yīng)后的魚油乙酯，可通過分子蒸餾與甘油酯分離，并再次通過分子蒸餾提高其中EPA和DHA的含量。

表3 反應(yīng)前后脂肪酸的組成的比較（%）Table 3 Comparison of the fatty acid before and after reaction（%）

3 結(jié)論

利用國產(chǎn)固定化假絲酵母脂肪酶催化魚油乙酯（EPA和DHA含量為76.2%）和甘油三酯（EPA和DHA含量為28.87%）的酯交換反應(yīng)，得到EPA和DHA總量超過45%的甘油酯。通過單因素實驗及正交實驗得到了較優(yōu)的工藝條件：反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時間24h，底物質(zhì)量比為5∶4，加酶量為80U，不向反應(yīng)體系中加入水分。在該條件下酶反應(yīng)得到的甘油酯中EPA和DHA的含量分別為33.40%和13.10%，在該條件下脂肪酶重復(fù)利用7次仍能達到工藝目標。

[1]L Lawson，B Hughes.Human absorption of fish oil fatty acids as triacylglycerols，free acids，or ethyl esters[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1988，152（1）：328-335.

[2]I Ikeda，E Sasaki，H Yasunami，et al.Digestion and lymphatic transport of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids given in the form of triacylglycerol，free acid and ethyl ester in rats[J].Biochimica etBiophysica Acta（BBA）-Lipids and Lipid Metabolism，1995，1259（3）：297-304.

[3]鄭毅，鄭楠，卓進鋒，等.利用脂肪酶提高魚油中多不飽和脂肪酸（PUFAs）甘油酯[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學報，2005，11（5）：571-574.

[4]Y Tanaka，T Funada，J Hirano，et al.Triglyceride specificity of Candida cylindracea lipase：Effect of docosahexaenoic acid on resistance of triglyceride to lipase[J].Journal of the American Oil Chemists’ Society，1993，70（10）：1031-1034.

[5]石紅旗，繆錦來，李光友，等.脂肪酶催化水解法濃縮魚油DHA甘油酯的研究[J].中國海洋藥物，2001（4）：15-21.

[6]吳可克.酶促魚油選擇性水解制備EPA，DHA甘油酯的研究[J].中國油脂，2002，27（3）：91-93.

[7]T Yamane， T SuzμLsi， Y Sahashi， et al.Production of n-3 polyunsaturated fatty acid-enriched fish oil by lipase-catalyzed acidolysis without solvent[J].Journal of the American Oil Chemists’Society，1992，69（11）：1104-1107.

[8]王運吉，張傳明.固定化胞內(nèi)脂肪酶選擇性水解魚油[J].食品工業(yè)科技，2003，24（1）：30-33.

[9]于晨旭，張苓花，王運吉.魚油多烯脂肪酸的純化及酶促酯交換反應(yīng)[J].大連輕工業(yè)學院學報，1997，16（4）：63-66.

[10]楊博，楊繼國，呂效揚，等.脂肪酶催化魚油醇解富集 EPA和 DHA 的研究[J].中國油脂，2005，30（8）：64-67.

[11]L Cerdan， A Medina， A Gimenez， et al.Synthesis of polyunsaturated fatty acid-enriched triglycerides by lipasecatalyzed esterification[J].Journal of the American Oil Chemists’Society，1998，75（10）：1329-1337.

[12]劉書成，章超樺，洪鵬志，等.有機溶劑中酶促酯化合成n-3 PUFA甘油酯的研究[J].中國糧油學報，2006，21（3）：146-151.

[13]孫素玲，張干偉，湯堅，等.酶促酯化合成多不飽和脂肪酸甘油酯[J].食品工業(yè)科技，2006，27（8）：139-141.

[14]B Jennings，C Akoh.Enzymatic modification of triacylglycerols of high eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids content to produce structured lipids[J].Journal of the American Oil Chemists’Society，1999，76（10）：1133-1137.

Preparation of glycerides rich in EPA and DHA by lipase-catalyzed transesterification between ethyl esters and triglycerides

GUO Zheng-xia，SUN Zhao-min，ZHANG Qin，WANG Jing-feng，XUE Chang-hu*
（Food Science and Engineering College，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

TS254.5+3

B

1002-0306（2012）20-0215-05

2012-05-04 *通訊聯(lián)系人

郭正霞（1988-），女，在讀碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)化學。

“泰山學者”建設(shè)工程專項經(jīng)費；國際科技合作項目（2010DFA31330）；長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃。