金映虹，黎佳媛，王銳萍，謝秀禎，黃循吟

（海南師范大學(xué) 生 命科學(xué)學(xué)院，海南 海口 571158）

厭氧消化池產(chǎn)甲烷菌的篩選及特性研究

金映虹，黎佳媛，王銳萍，謝秀禎，黃循吟*

（海南師范大學(xué) 生 命科學(xué)學(xué)院，海南 海口 571158）

從厭氧消化池活性污泥中采集樣品，利用特定培養(yǎng)基進行厭氧培養(yǎng)，分離篩選得到2株菌，分別編號為A、B.通過特定熒光反應(yīng)檢測鑒定A、B均為產(chǎn)甲烷菌.利用甲醇液體培養(yǎng)基對A、B兩種菌株進行培養(yǎng)，20 d后兩株菌均產(chǎn)生甲烷，且通過自制氣體收集裝置測定其產(chǎn)氣量發(fā)現(xiàn)，B菌株的產(chǎn)氣量高于A菌株.

厭氧消化池；產(chǎn)甲烷菌；篩選

沼氣發(fā)酵是自然環(huán)境中極其典型，且又十分普遍的厭氧消化反應(yīng)，是一種由多種不同種類的微生物交替聯(lián)合作用來分解代謝各類有機質(zhì)成分，從而不斷產(chǎn)生沼氣的反應(yīng)過程.在沼氣發(fā)酵的過程中，產(chǎn)甲烷菌作為核心沼氣發(fā)酵微生物，不僅是一種能夠利用有機或無機化合物通過厭氧發(fā)酵，從而將其轉(zhuǎn)化成甲烷和二氧化碳的菌，而且產(chǎn)甲烷菌屬于水生古細菌門（Euryarchaecta），能夠在各種各樣的自然環(huán)境中生存，例如人類的消化系統(tǒng)中、反芻動物的瘤胃中、湖泊、稻田或海底的沉積物中、鹽池和熱油層等極端自然環(huán)境中[1]，以及沼氣反應(yīng)裝置和污泥消化等人造的環(huán)境中.雖然產(chǎn)甲烷菌形態(tài)極不相同，但是其生理功能卻驚人的相似，即均能夠產(chǎn)生甲烷氣體.產(chǎn)甲烷菌作為自然界碳素循環(huán)中厭氧生物鏈中的最后一位成員，對其的研究能夠幫助了解其發(fā)酵的過程，優(yōu)化發(fā)酵條件，進而提高沼氣的產(chǎn)量[2]，有利于大量生產(chǎn)這種可再生能源.

人類于1899年開始對產(chǎn)甲烷菌進行研究.俄國著名微生物學(xué)家的奧姆良（B.L.Omelauskie）將微生物中能夠厭氧分解纖維素的菌分為兩類：一類是產(chǎn)甲烷細菌，后來被稱為奧氏甲烷桿菌（Mel-hano?bacillus Omelauskii）；另一類是能夠產(chǎn)生許多氫的細菌，后來被稱為產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌.1901年，孫根（Sohngen）對產(chǎn)甲烷菌的特征，以及產(chǎn)甲烷菌對物質(zhì)的轉(zhuǎn)化做了更加詳細地研究[3-4].由于厭氧分離甲烷菌的設(shè)備和技術(shù)尚不完備，對奧氏甲烷菌所做的分離研究工作并未取得重大的進展[3]，直到20世紀(jì)70年代中期，產(chǎn)甲烷菌只有一個科，被稱作甲烷桿菌科，并且分成三個屬，九個種[4].1950年，科學(xué)家亨格特（Hungate）首次創(chuàng)造了嚴(yán)格無氧分離技術(shù)，這一技術(shù)對于甲烷菌的研究具有十分重要的意義[3].隨后，人們從各種不同的厭氧生態(tài)環(huán)境中分離得到的甲烷菌分為5個目，依次是甲烷球菌目（Methanococcales）、甲烷桿菌目（Methanobacteria?les）、甲烷超高溫菌（Methanopyrales）、甲烷微菌目（Methanomicrobiales）和甲烷八疊球菌目（Methano?sarcinales）[5].1974年，生物學(xué)家Bryant第一次提出了產(chǎn)甲烷菌（Methanotrops）這一詞，從而將之與以甲烷為能量來源的嗜甲烷菌（Methanotrophs）區(qū)分開來.Schnellen第一個從消化污泥中分離純化得到巴氏甲烷八疊球菌（Methanosa rcina barker）以及甲酸甲烷桿菌（Methanobact erium formicium），到目前為止，通過一代又一代的學(xué)者的努力，經(jīng)過分離鑒定的產(chǎn)甲烷菌總共有200多種[6]，隨著研究的深入研究數(shù)目也在不斷地增加中.

20世紀(jì)以來，全球范圍內(nèi)出現(xiàn)了嚴(yán)重的能源危機，這就迫使各國竭力尋找新能源和可再生能源.與此同時，環(huán)境問題也嚴(yán)重威脅到人類的生命健康安全和生存發(fā)展，由此，各個國家越來越重視生物能源和可再生能源利用的研究工作和進展.厭氧消化技術(shù)在環(huán)境保護和能源生產(chǎn)等領(lǐng)域具有十分顯著的優(yōu)勢.產(chǎn)甲烷菌能夠有效地分解糞便和污泥中的有機質(zhì)成分，從而產(chǎn)生沼氣，這樣不但減少了環(huán)境污染，而且能夠提供廉價的可再生能源.因此，對其研究工作一直在進行中.但是，由于產(chǎn)甲烷菌的培養(yǎng)必須在嚴(yán)格厭氧的環(huán)境中方能夠進行，這就導(dǎo)致對其研究主要集中于產(chǎn)甲烷菌的分類學(xué)研究方面[7-12]，應(yīng)用方面則尚有一定的難度.

改革開放以來，我國經(jīng)濟飛速發(fā)展，人民生活水平不斷提高，污水排放量急劇增加，污水處理廠作為污水處理的最重要環(huán)節(jié)，其生存和發(fā)展問題理應(yīng)受到政府各部門的重視和扶持.海南省白沙門污水處理廠擔(dān)負著?？谑谐鞘?0%以上污水處理量，但是污水處理費用的收取問題、電力投入不足的問題等問題一直制約著污水廠的發(fā)展，如果能夠提高厭氧消化的產(chǎn)甲烷量，利用甲烷氣體燃燒發(fā)電，為污水處理提供部分電能，那么就能夠降低污水處理的成本，提高污水處理廠的經(jīng)濟效益，必然有益于其長遠發(fā)展.

本研究通過對白沙門污水處理廠的活性污泥進行分離純化，篩選出2株產(chǎn)甲烷氣體的菌株，通過特定熒光反應(yīng)檢測鑒定A、B均為產(chǎn)甲烷菌，且2株菌均能產(chǎn)生大量甲烷氣體，通過自制氣體收集裝置測定其產(chǎn)氣量發(fā)現(xiàn)，B菌株的產(chǎn)氣量高于A菌株，這為后續(xù)實驗提供高產(chǎn)菌株，以便與硫酸鹽還原菌、脫氮硫桿菌進行混合培養(yǎng)，提高污水處理過程中的甲烷氣體產(chǎn)量，抑制硫化氫的產(chǎn)生，降低設(shè)備的耗損，進而降低白沙門污水處理廠的成本等奠定了研究基礎(chǔ)[13].

1 材料與方法

1.1 菌株分離及鑒定

1.1.1 菌種來源

菌種來源于?？谑邪咨抽T污水處理廠厭氧消化池的活性污泥.

1.1.2 培養(yǎng)及篩選

將篩選培養(yǎng)基（氯化鎂：0.1 g/L；乙酸：3.5 mL/L；甲醇：3.5 mL/L；磷酸二氫鉀：0.4 g/L；磷酸氫二鉀：0.4 g/L；氯化銨：1 g/L；酵母浸膏：1 g/L；pH：7～8；固體培養(yǎng)基中加入瓊脂，20 g/L），滅菌后，向培養(yǎng)基中加入事先配制好的、經(jīng)過過濾除菌的硫化鈉溶液，每1000 mL加入20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的硫化鈉.

將取來的污泥稀釋適當(dāng)倍數(shù)，涂布在篩選培養(yǎng)基平板上，用蠟將培養(yǎng)皿封口，倒置置于35℃培養(yǎng)箱中，或直接放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h，使僅能夠利用特定有機碳源和由氯化銨提供氮源的菌株成為優(yōu)勢菌株.經(jīng)過多次挑菌畫線培養(yǎng)，分離純化目的菌株[14-15].

1.1.3 革蘭氏染色

將分離純化后的菌株進行革蘭氏染色，觀察染色結(jié)果.

1.1.4 特定熒光反應(yīng)檢測

利用接種針進行無菌操作挑取少許菌體，置于已經(jīng)滴有一滴碳酸鹽緩沖液（0.5 mol/L pH 9.0～9.5）的載玻片上，均勻涂布，然后滴加一滴甘油，并用接種針均勻涂布，蓋上蓋玻片，貼上標(biāo)簽紙，寫好菌號.熒光顯微鏡需預(yù)熱5～15 min，在制片完成以后，將片置于熒光顯微鏡的置物臺上，首先在低倍鏡下找到觀察目標(biāo)，然后轉(zhuǎn)換為高倍鏡，最后將激發(fā)濾片轉(zhuǎn)換為紫外激發(fā)濾片.由于熒光具有專一性的特定，一般都比激發(fā)光弱，為了能夠方便地觀察到專一熒光，需在物鏡后面加阻斷（或者是壓制）濾光片，同時調(diào)節(jié)波長至420 nm，通過目鏡觀察菌落是否激發(fā)產(chǎn)生了蘭—綠色熒光，若有，則說明菌為產(chǎn)甲烷菌，若無，則不是.

1.2 產(chǎn)氣性能測定

1.2.1 預(yù)培養(yǎng)

將篩選培養(yǎng)基中的3.5 mL乙醇替換成3.5 mL甲醇，使培養(yǎng)基中甲醇的量增加至7 mL，滅菌后加入硫化鈉.將菌接種到含有50 mL該液體培養(yǎng)基的三角瓶中，然后置于厭氧培養(yǎng)箱中，進行預(yù)培養(yǎng).

1.2.2 氣體收集實驗

培養(yǎng)結(jié)束后，將菌液通過無菌操作轉(zhuǎn)移入集氣裝置中含500 mL甲醇培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，通過無菌操作將集氣裝置連接，利用夾子控制氣體收集，裝置連接完畢后，利用石蠟將裝置的接口處（如瓶口與橡皮塞之間、玻璃管與橡皮管之間）密封起來，防止氣體外泄.置于室溫進行培養(yǎng).

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)甲烷菌分離及鑒定

2.1.1 初篩

通過篩選培養(yǎng)基以及提供低氧培養(yǎng)條件進行初篩，得到四株菌株，其菌落形態(tài)見圖1.

由圖1可見：（a）菌的菌落呈黃色，邊緣光滑；（b）菌的菌落呈褐黃色，邊緣呈不平整；（c）菌的菌落呈乳白色，且邊緣為褶皺狀；（d）菌的菌落呈綠色.

圖1 初篩所得菌株菌落形態(tài)觀察Fig.1 Shape of the preliminary screening strains colony

2.1.2 復(fù)篩

在初篩所得菌株的基礎(chǔ)上，通過畫線接種純化，提供嚴(yán)格厭氧的培養(yǎng)條件，最終從初篩的c菌復(fù)篩得到A菌株，從初篩的a菌復(fù)篩得到B菌株.它們的菌落形態(tài)見圖2.

圖2 復(fù)篩所得菌株菌落形態(tài)觀察Fig.2 Shape of the repeat screening strains colony

A菌株的菌落邊緣平滑；B菌株的菌落邊緣光滑.兩株菌生長初期，菌落為乳白色，8 d后全部變?yōu)榈S色.

2.1.3 革蘭氏染色和細胞形態(tài)觀察

通過革蘭氏染色鏡檢，A菌株為球菌，革蘭氏染色為陰性；B菌株也是球菌，但革蘭氏染色為陽性（見圖3）.

2.1.4 特定熒光反應(yīng)觀察結(jié)果

圖3 革蘭氏染色和細胞形態(tài)觀察結(jié)果Fig.3 Results of shape of cell and Gram stain

研究成果表明，到目前為止，除了產(chǎn)甲烷菌外，尚未發(fā)現(xiàn)其他專性厭氧的微生物含有其他在420 nm激發(fā)能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)以及輔酶F420，而輔酶F420和甲基喋呤類化合物則為大多數(shù)產(chǎn)甲烷菌所含有，這就使得僅僅產(chǎn)甲烷菌能夠在420 nm紫外光激發(fā)下產(chǎn)生蘭—綠色熒光，利用熒光顯微鏡檢測，觀察菌落是否產(chǎn)生熒光，這項檢測項目已經(jīng)成為鑒定產(chǎn)甲烷菌的一種重要的技術(shù)手段[13].

由圖4可知，A菌株和B菌株均觀察到了蘭—綠色熒光反應(yīng)，由此可以初步確定A菌株和B菌株均為產(chǎn)甲烷菌.

2.2 產(chǎn)氣性能試驗結(jié)果

2.2.1 菌株在甲醇培養(yǎng)基中的生長情況

A菌株接種到甲醇液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，觀察到有白色絮狀物質(zhì)，且是直立狀生于瓶內(nèi).培養(yǎng)6 d后，觀察到白色絮狀物質(zhì)增多，且均勻分布于培養(yǎng)基內(nèi)，液體底部、中部和表面均有菌生長；而B菌株接種到甲醇液體培養(yǎng)基中，經(jīng)過24 h后，未能觀察到明顯的菌落生長.培養(yǎng)6 d后，觀察到液體培養(yǎng)基中均有黃色菌落分布，主要沉集在瓶子的底部，且液體表面亦有一層菌落（見圖5）.

由培養(yǎng)結(jié)果可知，A、B菌株均能在此甲醇液體培養(yǎng)基中生長，且比在篩選培養(yǎng)基上生長周期更短，因此利用甲醇液體培養(yǎng)基進行產(chǎn)氣性能試驗.

圖4 A、B菌株熒光反應(yīng)檢測結(jié)果Fig.4 Results of the specific fluoroscopy test of strain A and B

圖5 兩菌株在甲醇培養(yǎng)基中的培養(yǎng)結(jié)果觀察Fig.5 Results of cultivated strain A and B in methane mediun

2.2.2 產(chǎn)氣性能試驗結(jié)果

在第一次產(chǎn)氣實驗中，菌體首先經(jīng)過1 d的預(yù)培養(yǎng)，然后接種到集氣裝置的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng).培養(yǎng)8 d并未觀察到明顯的菌生長，直至第11天，培養(yǎng)液開始變渾濁，說明菌已經(jīng)開始生長.繼續(xù)培養(yǎng)至第15天，打開裝置上的夾子后，并未觀察到集氣裝置中液面的上升.隨后關(guān)閉夾子，繼續(xù)培養(yǎng).第22天時，打開A菌株、B菌株的集氣裝置，均觀察到液面的上移，記錄產(chǎn)氣量（見表1）.

表1 氣體收集結(jié)果Tab.1 Gas collection results

根據(jù)第一次實驗結(jié)果，使用相同的集氣裝置，將菌體的預(yù)培養(yǎng)時間延長至15天，再進行轉(zhuǎn)接.培養(yǎng)至第15天，打開夾子后，并未觀察到集氣裝置中液面的上升.隨后關(guān)閉夾子，繼續(xù)培養(yǎng).第20天時，打開A菌株、B菌株的集氣裝置橡皮管上的夾子，均觀察到液面的上移，記錄產(chǎn)氣量（見表1）.

據(jù)兩次試驗的結(jié)果可知，A、B兩株菌均能夠產(chǎn)生甲烷氣體，且B菌株的產(chǎn)氣能力比A菌株高.

3 結(jié)論

從海南省白沙門污水處理廠的厭氧消化池污泥中分離篩選得到的兩株菌（編號為A菌株和B菌株）.根據(jù)革蘭氏染色結(jié)果，A菌株為球狀革蘭氏陰性菌，B菌株為球狀革蘭氏陽性菌，完全符合對甲烷球菌屬的描述——球形細胞，革蘭氏陽性或陰性；并且通過熒光反應(yīng)檢測，進一步確定兩株菌均為產(chǎn)甲烷菌，因此，初步把A菌株和B菌株都歸為甲烷球菌屬.

通過甲醇液體培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d左右后，2株菌均能產(chǎn)生甲烷氣體，且B菌株產(chǎn)氣量比A菌株高.根據(jù)《伯杰氏手冊》中產(chǎn)甲烷菌的相關(guān)內(nèi)容，經(jīng)過15 d的培養(yǎng)后，即可觀察到氣體生成[16]，然而本實驗結(jié)果顯示培養(yǎng)15 d后未有氣體產(chǎn)生，需要繼續(xù)培養(yǎng)至20 d左右.其原因可能有兩方面：1）由于集器氣裝置是置于室溫下，平均溫度達不到35℃，而產(chǎn)甲烷菌的最適生長溫度為35℃，較低的培養(yǎng)溫度延緩了產(chǎn)甲烷菌地生長；2）由于裝置過大，無法放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中培養(yǎng)，裝置中無法保持較好的厭氧環(huán)境，這也抑制了產(chǎn)甲烷菌的生長.

在此基礎(chǔ)上，本研究組將進一步優(yōu)化產(chǎn)甲烷菌培養(yǎng)條件，提高產(chǎn)甲烷能力，為后續(xù)實驗提供高產(chǎn)菌株，以便與硫酸鹽還原菌、脫氮硫桿菌進行混合培養(yǎng)，提高污水處理過程中的甲烷氣體產(chǎn)量，抑制硫化氫的產(chǎn)生，降低設(shè)備的耗損，進而為降低污水處理廠的成本等奠定了研究基礎(chǔ).

[1]公維佳,李文哲,劉建禹.厭氧消化中的產(chǎn)甲烷菌研究進展[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006,37（6）:838-841.

[2]林代炎,林新堅,楊菁,等.產(chǎn)甲烷菌在厭氧消化中的應(yīng)用研究進展[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報,2008,23(1):106-110.

[3]郝鮮俊,洪堅平,高文俊.產(chǎn)甲烷菌的研究進展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(1):111-113.

[4]李美群,鄧潔紅,熊興耀,等.產(chǎn)甲烷菌的研究進展[J].釀酒科技,2009(5):90-93.

[5]傅霖,辛明秀.產(chǎn)甲烷菌的生態(tài)多樣性及工業(yè)應(yīng)用[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2009,15(4):574-578.

[6]劉亭亭,曹靖俞.產(chǎn)甲烷菌的分離及其生長條件研究[J].黑龍江水專學(xué)報,2007,34（4）:121-122.

[7]田沈,趙軍,曹亞麗,等.產(chǎn)甲烷菌固定化新方法及其甲烷化特點[J].太陽能學(xué)報,2002,23(6):778-781.

[8]郭立峰,李永峰,高大文.制藥廢水中產(chǎn)甲烷菌的分離與鑒定[J].哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2008,24(1):29-31.

[9]崔曉光.沼氣池中產(chǎn)甲烷菌的分離鑒定及其分布的研究[D].大連:大連理工大學(xué),2007.

[10]楊光.低溫對沼氣菌群產(chǎn)氣能力的影響以及差甲烷菌的分離[D].西安:西北農(nóng)林科技大學(xué),2008.

[11]Gareia J L Patel K C,OIIivier B.Taxonomic:phylogenet?ic and ecological diversity of methanogenic Archaea[J].Anaereber,2000,6(4):205-226.

[12]汪婷.沼氣發(fā)酵過程中產(chǎn)甲烷菌分子多樣性研究及產(chǎn)甲烷菌的分離[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[13]徐祖波,祖建,周富春,等.產(chǎn)甲烷菌的生理生化特性[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2008,31(3):6-7.

[14]龐德公,楊紅建.產(chǎn)甲烷菌的分離純化培養(yǎng)及培養(yǎng)基對菌株的選擇作用[J].中國畜牧獸醫(yī),2010,37（6）:32-35.

[15]張國政.產(chǎn)甲烷菌的一般特征探討[J].中國沼氣,1990,8(2):4-8.

[16]R.E.布坎南,N.E.擊本斯.伯杰細菌鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,1984:652-660.

責(zé)任編輯：黃 瀾

Research on Screening and Properties of Methanogen from Anaerobic Digester

JIN Yinghong，LI Jiayuan，WANG Ruiping，XIE Xiuzhen，HUANG Xunyin＊
（College of Life Science，Hainan Normal University，Hhaikou 571158，China）

Two strains of Methanogen were isolated from anaerobic digester by anaerobic culture,and identified by the specific fluoroscopy.They were marked as strain A and strain B.A gas collector was designed to collect the methane which was produced by strain A or B.The results showed that strain A and B both could produce gas after about 20 days cultivation with methanol liquid medium,and the gas production of B strain was more than A strain’s.

anaerobic digester；methanogen；screening

Q 939.9

A

1674-4942（2012）03-0295-05

2012-06-28

海口市重點科技計劃項目（2009030）

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