靳榮線，曹艷茹，2，苗翠蘋，李文均，姜 怡* ，吳少華*

1云南大學(xué)云南省微生物研究所西南微生物多樣性教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650091;2西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，楊凌 712100

從經(jīng)典的抗生素篩選到當(dāng)今借助微生物基因組學(xué)、宏基因組學(xué)等手段輔助藥物篩選，放線菌在天然產(chǎn)物的產(chǎn)生與篩選中都占有重要位置。所以，探尋新型放線菌資源、改善分離方法和提高未知放線菌的出菌率一直是放線菌研究的重要內(nèi)容。放線菌具有豐富的生物多樣性，其天然產(chǎn)物有著廣泛的生物學(xué)活性，是發(fā)現(xiàn)具有生物活性新型次生代謝產(chǎn)物的重要資源［1］。

隨著藥物研發(fā)水平的進(jìn)步，對(duì)先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)也不再局限于陸生植物。相對(duì)于植物內(nèi)生放線菌，對(duì)動(dòng)物腸道放線菌的研究發(fā)展較快，特別是對(duì)昆蟲共生放線菌的研究［2-4］。本實(shí)驗(yàn)室從2007年開始對(duì)西南特有幾種動(dòng)物的糞便放線菌進(jìn)行研究，并對(duì)從中得到的一些有生物活性的菌株進(jìn)行代謝產(chǎn)物的初步研究［5］。

菌株YIM 245為從長頸鹿糞便中分離得到的一株放線菌，通過對(duì)其培養(yǎng)特征和16S rRNA基因序列分析，屬于鏈霉屬(Streptomyces sp.)?？咕钚詸z測(cè)顯示該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗菌活性。因此，我們進(jìn)一步對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，從發(fā)酵提取物中分離得到7個(gè)化合物。依據(jù)理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)分析，分別鑒定為2'-脫氧胞嘧啶核苷(1)、2'-脫氧胸苷(2)、2'-脫氧尿苷(3)、2’-脫氧腺苷(4)、菜油甾醇(5)、大豆素(6)和鄰氨基苯甲酸(7)，7個(gè)化合物均顯示較弱的抗菌活性。

1 材料和方法

1.1 發(fā)酵菌株

菌株YIM 245從長頸鹿糞便中分離得到，經(jīng)純培養(yǎng)后，以38#瓊脂斜面保存在4°C。

1.2 指示菌株

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，白色念珠菌(Candida albicans)，大腸桿菌(Escherichia coli)，黑曲霉菌(Aspergillus niger)。

1.3 培養(yǎng)基

38#:葡萄糖4 g，酵母膏4 g，麥芽膏5 g，復(fù)合維生素微量(3.7 mg)，微量鹽1 mL，瓊脂13 g，蒸餾水1000 mL，pH7.2

302#:甘露醇20 g，大豆 20 g，蒸餾水1000 mL，pH7.8

LB:胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，酵母膏5 g，蒸餾水 1000 mL，pH7.2

PDA:土豆200 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1000 mL，pH自然

1.4 儀器與試劑

儀器:超凈工作臺(tái)(AirTech);隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);高速臺(tái)式離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠);SHI-22型水浴恒溫振蕩器(江蘇太倉醫(yī)療器械廠);電子天平(中山市新和科技開發(fā)有限公司);紫外燈(Shimadzu);Bruker DRX-500型超導(dǎo)核磁共振儀;Agilent G3250AA LC/MSD TOF型質(zhì)譜儀;EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

試劑:反相硅膠RP-18(Merck)，Sephadex LH-20(Pharmacia)，薄層層析用硅膠G板和柱層析硅膠200～300目(青島海洋化工廠);其他試劑均為分析純。

1.5 發(fā)酵液的制備

種子液制備:從新鮮斜面培養(yǎng)基中將菌株轉(zhuǎn)接到裝有100 mL 38#培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，于28℃、200 rpm搖床培養(yǎng)2 d。

將種子液轉(zhuǎn)接到裝有100 mL 302#培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中相同條件下?lián)u床培養(yǎng)7 d，共獲得發(fā)酵產(chǎn)物40 L。

1.6 提取分離

發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)4500 rpmn離心10 min得到發(fā)酵液和菌絲體，發(fā)酵液經(jīng)大孔樹脂HP-20吸附和乙酸乙酯萃取后減壓濃縮，菌絲體經(jīng)95%乙醇浸泡后減壓濃縮，根據(jù)TLC檢測(cè)，合并發(fā)酵液和菌絲體粗體物共140 g。發(fā)酵粗提物經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿-甲醇梯度洗脫，得到6個(gè)組分。組分1經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(95∶5)洗脫得化合物6(5 mg)。組分2經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(4∶1)洗脫得化合物2(8 mg)。組分3(5 g)經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚-丙酮(7∶3)洗脫，再經(jīng)凝膠Sephadex LH-20柱層析，用甲醇洗脫得化合物3(3 mg)。組分3經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(9∶1)洗脫得化合物4(3 mg)。組分4經(jīng)硅膠柱層析，用石油醚-乙酸乙酯(95∶5)洗脫得化合物5(4 mg)。組分6經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿-丙酮(9∶1)，再經(jīng) RP-18 反相柱層析，用甲醇-水(5∶95)洗脫得化合物7(5 mg)。組分7經(jīng)硅膠柱層析，用氯仿-甲醇(3∶1)洗脫得化合物1(2 mg)。

1.7 化合物的抑菌活性檢測(cè)

在長有指示菌的固體斜面培養(yǎng)基中加入1 mL無菌水，震蕩片刻制成指示菌懸液。將化合物1～7分別溶解于50%DMSO的水溶液中，配制成濃度為800(g∕mL的母液，用LB和PDA液體培養(yǎng)基將樣品分別倍比稀釋為八個(gè)濃度:800、400、200、100、50、25、12.5、6.25(g ∕ mL.按每孔 50 μL 將它們分別加入到96孔板中，再向每孔中加入50 μL活性指示菌菌懸液。以100(g∕ mL制霉菌素和青霉素為陽性對(duì)照，加入等體積PDA液體培養(yǎng)基的孔為陰性對(duì)照，不加菌液的孔為空白對(duì)照。上述每組樣品設(shè)置3個(gè)平行處理。將96孔板置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，肉眼觀測(cè)活性指示菌的生長狀況，以沒有指示菌生長的目標(biāo)產(chǎn)物的最低濃度為最小抑菌濃(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色固體;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:8.06(1H，d，J=7.4 Hz，H-6)，6.29(1H，t，J=6.1 Hz，H-1’)，5.94(1H，d，J=7.2 Hz，H-5)，4.38(1H，m，H-4’)，3.96(1H，m，H-3’)，3.82(1H，dd，J=11.8，3.0 Hz，H-5’a)，3.75(1H，dd，J=11.8，3.6 Hz，H-5’b)，2.38(1H，m，H-2’a)，2.16(1H，m，H-2’b);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:168.6(C-4)，158.5(C-2)，144.7(C-6)，98.6(C-5)，89.3(C-4’)，88.0(C-1’)，73.4(C-3’)，63.4(C-5’)，42.4(C-2’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［6］，故鑒定為2'-脫氧胞嘧啶核苷。

化合物2 白色晶體;1H NMR(Pyridine-d5，500 MHz)δ:8.13(1H，s，H-6)，7.01(1H，t，J=5.5 Hz，H-1’)，5.01(1H，m，H-4’)，4.45(1H，m，H-3’)，4.22(1H，d，J=11.7 Hz，H-5’a)，4.13(1H，d，J=11.7 Hz，H-5’b)，2.65(2H，m，H-2’)，1.98(3H，s，CH3);13C NMR(Pyridine-d5，125 MHz)δ:165.8(C-4)，152.7(C-2)，137.5(C-6)，111.3(C-5)，89.6(C-4’)，86.2(C-1’)，72.3(C-3’)，63.1(C-5’)，42.2(C-2’)，13.5(5-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［7］，故鑒定為2'-脫氧胸苷。

化合物3 白色晶體;1H NMR(Pyridine-d5，500 MHz)δ:8.34(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，6.96(1H，t，J=6.5 Hz，H-1’)，5.80(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，4.99(1H，m，H-4’)，4.46(1H，m，H-3’)，4.19(1H，d，J=11.7 Hz，H-5’a)，4.11(1H，d，J=11.7 Hz，H-5’b)，2.69(1H，m，H-2’a)，2.58(1H，m，H-2’b);13C NMR(Pyridine-d5，125 MHz)δ:166.0(C-4)，153.4(C-2)，142.4(C-6)，104.0(C-5)，90.5(C-1’)，87.1(C-4’)，72.9(C-3’)，63.8(C-5’)，43.1(C-2’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［7］，故鑒定為2'-脫氧尿苷。

化合物4 淡黃色粉末;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:8.40(1H，s，H-8)，8.18(1H，s，H-2)，6.45(1H，m，H-1’)，4.61(1H，m，H-3’)，4.10(1H，m，H-4’)，3.80(1H，m，H-5’a)，3.78(1H，m，H-5’b)，2.85(1H，m，H-2’a)，2.81(1H，m，H-2’b);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:157.9(C-6)，153.9(C-2)，150.3(C-4)，141.9(C-8)，121.2(C-5)，90.3(C-1’)，87.5(C-4’)，73.4(C-3’)，64.0(C-5’)，41.9(C-2’)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［7］，故鑒定為2'-脫氧腺苷。

化合物 5 白色粉末;1H NMR(CDCl3，500 MHz)δ:5.38(1H，brs，H-6)，3.57(1H，m，H-3)，1.04(3H，s，H-19)，0.94(3H，d，J=6.7 Hz，H-28)，0.90(3H，d，J=6.7 Hz，H-21)，0.84(3H，d，J=6.5 Hz，H-26)，0.79(3H，d，J=6.7 Hz，H-27)，0.70(3H，s，H-18);13C NMR(CDCl3，125 MHz)δ:141.2(C-5)，122.0(C-6)，72.2(C-3)，56.6(C-8)，56.5(C-9)，42.7(C – 14)，40.2(C-17)，37.6(C-4)，36.9(C-6)，32.5(C-1)，32.3(C-20)，32.1(C-2)，30.0(C-11)，29.7(C-24)，29.4(C-25)，28.6(C-12)，26.6(C-15)，24.7(C-16)，23.5(C-22)，21.6(C-12)，21.5(C-23)，20.1(C-19)，19.7(C-21)，19.4(C-24)，19.3(C-28)，19.1(C-27)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［8］，故鑒定為菜油甾醇。

化合物6 淡黃色晶體;1H NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ:10.79(1H，s，H-7)，9.55(1H，s，H-4’)，8.26(1H，s，H-2)，7.98(1H，d，J=8.6 Hz，H-5)，7.39(2H，d，J=7.9 Hz，H-2’，6’)，6.94(1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，6.86(1H，s，H-8)，6.83(2H，d，J=7.9 Hz，H-3’，5’);13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:175.0(C-4)，162.8(C-7)，157.8(C-9)，153.1(C-2)，130.8(C-2’)，130.4(C-6’)，127.6(C-5)，123.8(C-1’)，122.9(C-3)，117.0(C-10)，115.8(C-6)，115.4(C-3’)，115.3(C-5’)，102.4(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［9］，故鑒定為大豆素。

化合物7 淡黃色晶體;1H NMR(CD3OD，500 MHz)δ:7.83(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，7.25(1H，td，J=8.0，1.4 Hz，H-3)，6.75(1H，d，J=8.3 Hz，H-2)，6.58(1H，t，J=8.0 Hz，H-4);13C NMR(CD3OD，125 MHz)δ:172.0(C-7)，153.2(C-1)，135.4(C-3)，133.0(C-5)，118.1(C-4)，117.0(C-2)，112.2(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照一致［10］，故鑒定為鄰氨基苯甲酸。

圖1 化合物1～7的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The structures of compounds 1-7

2.2 化合物的抑菌活性結(jié)果

采用96孔板法測(cè)定了化合物1～7對(duì)5種病原指示菌的抑菌活性，結(jié)果均顯示較弱的抑菌活性(見表1)。

3 討論

本研究從非洲特有動(dòng)物長頸鹿的糞便環(huán)境中分離得到一株放線菌YIM 245，經(jīng)16S rRNA基因序列初步分析，其屬于鏈霉菌屬。從該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得了7個(gè)化合物，均為首次從該動(dòng)物糞便極端生境中分離獲得到，本研究為微生物資源的挖掘及代謝產(chǎn)物的分離提供一條新途徑。抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，7個(gè)化合物均顯示較弱的抑菌活性。在研究過程中由于某些代謝產(chǎn)物的含量較低、成分復(fù)雜，不能進(jìn)行有效的分離和結(jié)構(gòu)鑒定，今后還需對(duì)其中的微量成分進(jìn)一步深入研究，提高動(dòng)物糞便環(huán)境中放線菌資源及其活性代謝產(chǎn)物的開發(fā)與應(yīng)用。

表1 化合物1～7的抑菌活性Table 1 The antimicrobial activities of compounds 1-7

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