張小梅，楊榮平，勵(lì) 娜，王云紅，梁旭明

重慶市中藥研究院，重慶 400065

翼首草為川續(xù)斷科植物匙葉翼首草Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck 的干燥全草［1］。性寒，味苦，有小毒。具有解毒除瘟，清熱止痢，祛風(fēng)通痹之功效，為藏醫(yī)常用藥材。翼首草中的主要成分為齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷類化合物，此外還含有生物堿、多糖等化學(xué)成分。研究表明翼首草正丁醇部位總皂苷具有顯著的抗炎活性，且其抗炎的作用與消炎痛效果相似［2］。本文采用翼首草正丁醇部位皂苷成分中游離苷元熊果酸為對(duì)照品，對(duì)影響翼首草中熊果酸薄層色譜鑒別的因素進(jìn)行系統(tǒng)研究，為其質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù)。

1 材料

熊果酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110742-200516)，齊墩果酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110709-200505);高效硅膠G薄層板(青島海洋化工分廠);其他所用試劑均為分析純(重慶川東(集團(tuán))有限公司化學(xué)試劑廠)。

翼首草藥材共計(jì)13批，產(chǎn)自西藏、青海、四川等，其中有10批為全草，另外3批為根。經(jīng)重慶市中藥研究院院長(zhǎng)鐘國(guó)躍研究員鑒定為Pterocephalus hookeri(C.B.Clarke)Hoeck。樣品來源、產(chǎn)地見表1。

2 方法與結(jié)果

薄層色譜鑒別試驗(yàn)條件選擇中所用藥材均為上述藥材來源中的第2批藥材。經(jīng)初步鑒別實(shí)驗(yàn)和高效液相色譜含量考察，第2批藥材中游離的齊墩果酸和熊果酸的含量在收集到的13批藥材中適中，因此考察條件時(shí)所用藥材均為第2批，且第2批藥材量較大。

2.1 薄層鑒別方法的考察

2.1.1 對(duì)照品的選擇

取翼首草粉(過二號(hào)篩)1 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取齊墩果酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。取熊果酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1.3mg的對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國(guó)藥典2005年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各2～10 μL，點(diǎn)于同一羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上(接觸點(diǎn)樣)，以三氯甲烷-丙酮(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。同時(shí)置紫外光燈(365 nm)下檢視，結(jié)果，熊果酸與齊墩果酸在薄層色譜上很難分開，并且經(jīng)多種展開劑的選擇，兩斑點(diǎn)依然重疊。經(jīng)實(shí)驗(yàn)的初步考察發(fā)現(xiàn)，入藥部位為根的3批藥材中，齊墩果酸的含量較熊果酸的含量稍高，而入藥部位為全草的另外10批藥材均是熊果酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于齊墩果酸的含量，因此選擇熊果酸為對(duì)照品來鑒別翼首草藥材。

表1 翼首草藥材來源、產(chǎn)地一覽表Table 1 Source，origin list of Yishoucao

圖1 環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯(6∶2∶1)(13℃/66%)Fig.1 Cyclohexane-Acetone-Ethyl acetate(6∶2∶1)(13 ℃ /66%)

圖4 三氯甲烷-丙酮(12∶1)(10℃/60%)Fig.4 Chloroform-Acetone(12∶1)(10 ℃ /60%)

2.1.2 展開系統(tǒng)的考察

按2.1.1項(xiàng)下擬定的薄層鑒別法進(jìn)行試驗(yàn)，分別以環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯(6∶2∶1)［3］、環(huán)己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(20∶5∶4∶2)、三氯甲烷-丙酮(4∶1)［4］、三氯甲烷-丙酮(12∶1)為展開劑，結(jié)果見圖1～4。以展開系統(tǒng)三氯甲烷∶丙酮(12∶1)展開距離適當(dāng)，供試品中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰且干擾小。

2.1.3 樣品處理方法的考察

2.1.3.1 提取溶媒的考察

取翼首草粉(過二號(hào)篩)1 g(5份)，精密稱定，置錐形瓶中，分別加無水乙醇、95%乙醇、乙醚、三氯甲烷、甲醇各20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為不同溶劑提取供試品溶液。由圖1-4可知，乙醚和三氯甲烷提取的樣品雜質(zhì)較95%乙醇、甲醇和無水乙醇少，顯色后在與對(duì)照品熊果酸相應(yīng)的位置上斑點(diǎn)較清晰且干擾小。因此選擇乙醚作為提取溶劑。

2.1.3.2 溶媒用量的考察

取翼首草粉(過二號(hào)篩)1 g(3份)，精密稱定，置錐形瓶中，分別加10、20、30 mL乙醚，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。按2.1.1項(xiàng)下擬定的薄層鑒別法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果，乙醚用量為30 mL時(shí)，供試品中提取的熊果酸相對(duì)較多，顯色后日光和熒光較清晰并能有效鑒別翼首草藥材，因此未考察更多溶劑用量。因此正文中選擇供試品溶劑用量為30 mL。

2.1.3.3 超聲時(shí)間的考察

取翼首草粉(過二號(hào)篩)1 g(4份)，精密稱定，置錐形瓶中，分別加30 mL乙醚，超聲處理10、20、30、40 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。按2.1.1項(xiàng)下擬定的薄層鑒別法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果，超聲10和20 min時(shí)顯色后日光和熒光斑點(diǎn)較30和40 min不清晰。而超聲30和40 min熊果酸顯色后的斑點(diǎn)差不多，較清晰。因此正文中選擇供試品超聲時(shí)間為30 min。

2.1.4 點(diǎn)樣量的考察

2.1.4.1 點(diǎn)樣量 1

分別取13批翼首草粉(過二號(hào)篩)各1 g，精密稱定，置錐形瓶中，分別加30 mL乙醚，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。吸取各供試品溶液各4 uL，按2.1.1項(xiàng)下擬定的薄層鑒別法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果，第4、6、8批點(diǎn)樣4 uL濃度太低，與熊果酸相對(duì)應(yīng)的點(diǎn)顯色后不太清晰、而其它多批如第 5、7、9、10、11、12、13 批點(diǎn)樣4 uL濃度太高，與熊果酸相對(duì)應(yīng)的點(diǎn)顯色后有拖尾的現(xiàn)象，因此應(yīng)選擇不同批樣品點(diǎn)樣不同。

2.1.4.2 點(diǎn)樣量 2

按2.1.1項(xiàng)下擬定的薄層鑒別法進(jìn)行試驗(yàn)，吸取除第4、6、8批樣品溶液8 uL，吸取其它溶液各2 uL點(diǎn)樣。結(jié)果，除第4、6、8批供試品溶液點(diǎn)樣8 uL，吸取其它溶液各2 uL點(diǎn)樣合適。

2.1.5 展開環(huán)境的考察

2.1.5.1 飽和缸和板的考察

按2.1.1項(xiàng)下擬定的薄層鑒別法進(jìn)行試驗(yàn)，其中一個(gè)預(yù)飽和層析缸和板共20 min;另一個(gè)飽和缸20 min后分別展開。結(jié)果，飽和缸和板的薄層板邊緣效要小，對(duì)照品和樣品顯色后斑點(diǎn)清晰且整齊;而只飽和缸的對(duì)照品和樣品顯色后斑點(diǎn)清晰，但樣品和對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的點(diǎn)邊緣效應(yīng)大。因此翼首草薄層鑒別應(yīng)飽和缸和板。

2.1.5.2 飽和時(shí)間的考察

分別飽和缸和板 5、10、20 min 后，按 2.1.1 項(xiàng)下擬定的薄層鑒別法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果，飽和缸和板5 min時(shí)顯色后樣品和對(duì)照品斑點(diǎn)清晰但邊緣效應(yīng)較飽和缸和板10、20 min差，而飽和缸和板10、20 min時(shí)斑點(diǎn)清晰且邊緣效應(yīng)較小，因此選擇飽和缸和板10 min。

2.1.5.3 溫度的考察

分別在溫度為10、20、30、40 ℃條件下，按2.1.1 項(xiàng)下擬定的薄層鑒別法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果，不同溫度對(duì)翼首草藥材的薄層鑒別沒有影響。

2.1.5.4 濕度的考察

分別在濕度為40%、60%、80%條件下，按2.1.1項(xiàng)下擬定的薄層鑒別法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果，不同濕度對(duì)翼首草薄層鑒別沒有影響。

2.1.6 翼首草的薄層鑒別

取本品粉末1 g(13批)，精密稱定，置錐形瓶中，加乙醚30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取熊果酸對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各2～8 uL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮(12∶1)為展開劑，飽和缸和板10 min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。同時(shí)置紫外光燈(365 nm)下檢視，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。13批樣品均能鑒別出熊果酸。結(jié)果見圖5。(沙棘)，2003，16(4):33-34.

圖5 翼首草樣品薄層鑒別(11℃/80%)Fig.5 Thin-layer chromatography of Yishoucao(11℃/80%)

3 討論

3.1 藏藥翼首草為2010版藥典新上藥材品種，本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)翼首草中熊果酸的薄層鑒別進(jìn)行系統(tǒng)研究，經(jīng)全國(guó)4個(gè)主產(chǎn)區(qū)、13批藥材進(jìn)行了多次重復(fù)試驗(yàn)，表明本法斑點(diǎn)清晰，易于檢出，分離效果較好、重現(xiàn)性好，能有效控制翼首草藥材的質(zhì)量。

3.2 從翼首草液相含量測(cè)定結(jié)果知，3批根中熊果酸含量明顯低于齊墩果酸，本文從薄層圖上也可以驗(yàn)證看出3批根在與熊果酸對(duì)照品相應(yīng)的位置上斑點(diǎn)相對(duì)其它批次較小，顏色相對(duì)較淡，從一定程度上這也能有效區(qū)別根與帶根全草之間的質(zhì)量差別，為臨床提供一定參考依據(jù)。

3.3 由于山茱萸、山楂、梔子、木瓜等中藥中均含有熊果酸，也可以熊果酸為對(duì)照品鑒別相應(yīng)藥材，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，因此有必要分離專屬成分來鑒別翼首草藥材，對(duì)翼首草藥材中的成分有待進(jìn)一步研究。

1 State Administration of traditional Chinese materia medica editorial board.Chinese herbal medicine，Tibetan Medicine Vol.(中華本草·藏藥卷).Shanghai:People’s Medical Publishing House，2002:366-368.

2 The people＇s Republic of China Pharmacopoeia Committee of Ministry of health.The people＇s Republic of China Ministry of Health(Tibetan Medicine)Book 1(中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥)第一冊(cè)).1995，138.

3 Chinese Pharmacopeia(ChP，1).2005:31.

4 Dong HL(董海麗)，Zong W(縱偉).Determination of oleanolic acid in Chinese quince by thin layer seperationspectrophotometry method.Anhui Agric Sci Bull(安徽農(nóng)學(xué)通報(bào))，2007，13(15):26.