李 青 汪 艷 張 曦 朱慧芬 唐良萏

1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產科，重慶 400016；2.安徽醫(yī)科大學附屬安慶醫(yī)院婦產科，安徽安慶 246000

卵巢腫瘤干細胞中趨化因子的表達與細胞侵襲轉移能力的關系

李 青1,2汪 艷2張 曦2朱慧芬2唐良萏1▲

1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產科，重慶 400016；2.安徽醫(yī)科大學附屬安慶醫(yī)院婦產科，安徽安慶 246000

目的探討卵巢腫瘤干細胞中趨化因子的表達與細胞侵襲轉移能力的關系，為卵巢腫瘤的治療提供新的研究思路和藥物作用靶點。 方法 采用流式細胞術與RT-PCR方法檢測卵巢腫瘤干細胞系CAOV-3中CXCR4的表達，通過體外微孔隔離室（Transwell）檢測CXCR4對CAOV-3細胞侵襲轉移能力的影響。 結果 CXCR4在CAOV-3中細胞呈陽性表達，CXCL12可促進CAOV-3細胞的遷移，CXCR4的封閉能抑制CXCL12對CAOV-3遷移的促進作用。 結論CXCL12-CXCR4相互作用可促進卵巢腫瘤干細胞侵襲轉移，在卵巢腫瘤的生長和侵襲轉移過程中起著重要作用。

卵巢腫瘤干細胞；CXCL12；CXCR4；CAOV-3；侵襲轉移

▲通訊作者：唐良萏，教授，博士生導師。

隨著社會經濟的發(fā)展與環(huán)境的各種影響，當前我國卵巢腫瘤發(fā)病率越來越高，并且預后嚴重。2009年有調查顯示，我國卵巢腫瘤死亡率居女性生殖道惡性腫瘤之首。眾所周知，卵巢腫瘤一個很重要的特征就是容易發(fā)生細胞侵襲轉移，這種轉移特性除了與患者自身原因有關外，卵巢腫瘤干細胞中的趨化因子發(fā)揮了重要的作用[1]。已有研究表明多種趨化因子可在卵巢惡性腫瘤中高表達，如近年研究較多且作用較肯定的有白細胞介素8（IL-8）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）和巨噬細胞炎性蛋白-1（MIP-1）等。 CXCR4（CXC chemokinereceptor 4）是一種趨化因子受體，能在卵巢腫瘤干細胞上特異表達，是當前研究的14個趨化因子受體中唯一在卵巢腫瘤干細胞上表達的；趨化因子CXCL12族（過去又稱SDF-1，stromal cell derived factor-1）與其特異性受體CXCR4所構成的復合體在多卵巢腫瘤的分布與侵襲轉移中發(fā)揮著重要的作用[2]。本研究從體外實驗水平探討卵巢腫瘤干細胞CXCR4表達變化對卵巢腫瘤細胞侵襲轉移的影響，希望為卵巢腫瘤的治療提供新的研究思路和藥物作用靶點。

1 資料與方法

1.1 卵巢腫瘤干細胞的培養(yǎng)

本實驗所用CAOV-3卵巢細胞株和Anglne細胞株分別購自中國科學院上海細胞所與北京微生物所，將細胞分別接種于含10%胎牛血清標準培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)24 h，確保細胞數不少于1×104個。

1.2 卵巢腫瘤干細胞穩(wěn)定表達CXCR4體系的建立

取 2×107細胞，PBS（磷酸鹽緩沖液）洗 2 次，SIGMA Trizol試劑盒一步法提取卵巢腫瘤干細胞總RNA。Promega反轉錄試劑盒進行反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR），以tubulin作為內參照，取2.5 μL反轉錄PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙啶染色，紫外光檢測儀觀察PCR合成結果。引物（北京三博合成）：正向 5’-TACCATGCCAGGGGATCA-3’，反向 5’-CTTGGCCTGTGACTGTT-3’，PCR 產物長度約為450 bp。同時也采用免疫熒光標記流式細胞術分析法檢測卵巢腫瘤干細胞CXCR4的表達。

1.3 趨化活性檢測

本組卵巢腫瘤干細胞達CXCR4體系趨化活性檢測采用Transwell分析：細胞穩(wěn)定生長至70%～90%融合時，PBS清洗兩遍，然后用無血清培養(yǎng)液把多細胞組合培養(yǎng)成單細胞懸液，顯微鏡下計數細胞，PBS清洗濃度調至1×106細胞/mL。將Transwell侵襲小室放入24孔板內，卵巢腫瘤干細胞接種于Transwell侵襲小室的上室，每上室加0.2 mL單細胞懸液，下室加0.4 mL無血清培養(yǎng)液，然后分為5組：（1）上室為包含單細胞懸液的無血清培養(yǎng)液，下室純?yōu)闊o血清培養(yǎng)液。（該組為對照組）（2）上室為包含單細胞懸液的無血清培養(yǎng)液，下室包含CXCL12（濃度為10 ng/mL）的無血清培養(yǎng)液。（3）上室為包含單細胞懸液的無血清培養(yǎng)液，下室為包含CXCL12（濃度為100 ng/mL）的無血清培養(yǎng)液。（4）上室為包含CXCR4中和抗體（濃度為10 μg/mL）的無血清培養(yǎng)液，下室為包含CXCL12（濃度為10 ng/mL）的無血清培養(yǎng)液。（5）上室為包含CXCR4拮抗劑AMD3100（濃度為10 μg/mL）和單細胞懸液的無血清培養(yǎng)液，下室為包含CXCL12（濃度為100 μg/mL）的無血清培養(yǎng)液。培養(yǎng)后將上面5種方法培養(yǎng)后的細胞用PBS沖洗2次，棉拭子擦去未侵襲轉移的細胞，無菌風干后用0.1%結晶紫染色20 min，然后用自來水沖洗干凈。400倍顯微鏡下每張切片隨機記錄3個視野的侵襲轉移細胞數，然后進行平均統(tǒng)計，觀察CXCR4的表達對卵巢腫瘤干細胞侵襲轉移的影響。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件進行數據處理，侵襲轉移數據均以均數±標準差（±s）表示，兩兩比較應用 χ2檢驗，P ＜ 0.05代表差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CXCR4的表達

流式細胞術檢測結果提示，CAOV-3卵巢細胞株表達中等量的CXCR4分子，RT-PCR則進一步證實該細胞存在一定量的CXCR4分子的轉錄。而在Anglne細胞中CXCR4無表達。具體情況見圖1。

2.2 CXCR4的表達對卵巢腫瘤干細胞侵襲轉移的影響

對于CAOV-3/CXCR4細胞來說，當Transwell小室的下室中加入10 ng/mL的CXCL12時，發(fā)生侵襲轉移的細胞數與對照組相比增多（P＜0.05）；100 ng/mL CXCL12加入使侵襲轉移的細胞數更明顯增多（P＜0.05），也明顯高于10 ng/mL CXCL12組；不過當上室加入10 ng/mLCXCR4中和抗體或10 μg/mL CXCR4拮抗劑AMD3100時，能抑制CXCL12對卵巢腫瘤干細胞的趨化性侵襲轉移 （P＜0.05），同時拮抗劑AMD3100加入時下降趨勢更加明顯（P＜0.05）。具體情況見表1。

3 討論

眾所周知，腫瘤的發(fā)生轉移是一個復雜的、微觀的、多信號的連續(xù)多階段過程，腫瘤發(fā)生轉移過程涉及腫瘤干細胞的發(fā)生、成熟、運動、侵襲、轉移、黏附和消亡。與其他多種類型的腫瘤細胞不同，卵巢腫瘤干細胞具有獨特的侵襲轉移規(guī)律，這種轉移特性除了與患者自身原因有關外，卵巢腫瘤干細胞中的趨化因子發(fā)揮了重要的作用[3]。

表1 CXCR4的表達對卵巢腫瘤干細胞侵襲轉移的影響（±s）

表1 CXCR4的表達對卵巢腫瘤干細胞侵襲轉移的影響（±s）

注：與對照組相比，*P＜0.05；與10 ng/mL CXCL12組相比，#P＜0.05；與100 ng/mL CXCL12組相比，△P＜0.05

項目 對照組 10 ng/mL CXCL12組 100 ng/mL CXCL12組 CXCR4抗體組 AMD3100組CAOV-3 CAOV-3/CXCR4 185.62±8.56 226.01±15.96 175.62±15.12 249.21±13.21*178.62±17.10 581.62±16.32#178.12±18.21 246.21±15.24△169.25±18.32 145.26±30.02△

趨化因子（chemokines）是一類具有趨化作用的細胞因子，是指具有吸引白細胞移行到感染部位的一些低分子量趨化因子（多為 8-10KD）的蛋白質（如 IL-8、MCP-1等），在炎癥反應中具有重要作用[4]。趨化因子的主要作用是趨化細胞的遷移，細胞沿著趨化因子濃度增加的信號向趨化因子源處的遷徙[5]。有些趨化因子在免疫監(jiān)視過程中控制免疫細胞趨化，如誘導淋巴細胞到淋巴結。有些趨化因子在發(fā)育中起作用；他們能刺激新血管形成；提供具體的關鍵信號而促成細胞成熟。其他趨化因子可以因應對細菌感染、病毒感染由多種細胞釋放；也可以因非感染性的刺激如二氧化硅吸入，尿路結石等而釋放。炎性趨化因子的主要作用是趨化白細胞從血循環(huán)到感染或組織損傷部位。有的趨化因子也可以促進傷口愈合[6]。

CXCR4是白細胞中的一種受體，在免疫系統(tǒng)中起著調整細胞運動的重要作用。當前大量的研究提示CXCR4有可能在腫瘤發(fā)生、侵襲轉移中發(fā)揮重要的作用。Vanderbilt-Ingram癌癥中心的科學家們發(fā)現，CXCR4作為受體，在神經膠質瘤的擴散過程中扮演著極其關鍵的角色[7]。但研究者們也表示，阻止CXCR4發(fā)揮受體的功能，雖然能大大削弱癌細胞擴散的能力，但不能完全制止它們的擴散。國外還有研究顯示約80%卵巢腫瘤組織中有CXCL12的受體CXCR4的表達，在95%卵巢腫瘤腹水中發(fā)現CXCL12，而在正常卵巢上皮中卻沒有表達[8]。2010年10月8日報道，美國科學家在最新出版的《科學》雜志報告稱，他們獲得了CXCR4分子結構的圖像，也了解了該分子的工作原理[9]。研究顯示，CXCR4分子同艾滋病病毒（HIV）感染和癌癥擴散有關，該分子會幫助HIV進入細胞，因此，阻斷該分子有望治療艾滋病和癌癥。一般而言，CXCR4也有助于激活免疫系統(tǒng)并且刺激細胞運動，但是，當激活受體的信號沒有被正確調制時，CXCR4會加速癌癥的惡化和擴散[7]。本文流式細胞術檢測結果提示，CAOV-3卵巢細胞株表達中等量的CXCR4分子，RT-PCR則進一步證實該細胞存在一定量的CXCR4分子的轉錄。而在Anglne細胞中CXCR4無表達[10]。

判斷腫瘤干細胞惡性程度最準確的指標就是細胞的侵襲和轉移[9]，本文以Transwell侵襲小室為模型，發(fā)現CXCL12能夠促進CAOV-3/CXCR4細胞的侵襲轉移 （P＜0.05）；同時高濃度CXCL12加入使侵襲轉移的細胞數更明顯增多（P＜0.05），也明顯高于10 ng/mL CXCL12組；不過當上室加入10 ng/mL CXCR4中和抗體或10 μg/mL CXCR4拮抗劑AMD3100時，能抑制CXCL12對卵巢腫瘤干細胞的趨化性侵襲轉移（P＜0.05），同時拮抗劑AMD3100加入時下降趨勢更加明顯（P＜0.05）。表明CXCL12-CXCR4生物軸對卵巢腫瘤干細胞的侵襲轉移有重要的影響。

總之，CXCL12-CXCR4相互作用可促進卵巢腫瘤干細胞侵襲轉移，在卵巢腫瘤的生長和侵襲轉移過程中起著重要作用。因此我們推斷抑制腫瘤細胞表面CXCR4的表達，干擾CXCL12-CXCR4的相互作用可能是抗腫瘤轉移的一個有意義的研究思路和藥物作用靶點。同時本研究成功構建高表達CXCR4的卵巢腫瘤干細胞株CAOV-3/CXCR4，為后續(xù)研究提供平臺和工具。

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The relation of chemokine expression and cell invasion and metastasis in the ovarian cancer stem cells

LI Qing1,2WANG Yan2ZHANG Xi2ZHU Huifen2TANG Liangdan1

1.Department of Obstertrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China;2.Department of Obstertrics and Gynecology,the Affiliated Anqing Hospital of Anhui Medical University,Anqing 246000,China

ObjectiveTo investigate the ovarian tumor stem cells chemokine expression and cell invasion and metastasis ability of relation,for the treatment of ovarian tumors to provide new research ideas and targets of drug action.Methods Expression of CXCR4 in ovarian cancer cellline CAOV-3 was detected by reverse transcriptase—polymerase chain reaction(RT-PCR)and flow cytometry;Transwell was used to analyze the invasion and metastasis of CAOV-3 cells in presence of CXCL12 or when CXCR4 was blocked by anti-CXCR4.Results CXCR4 in CAOV-3 cells showed positive expression,CXCL12 induced the invasion and metastasis of CAOV-3 cells，which could be effectively blocked by anti-CXCR4.Conclusion CXCL12-CXCR4 interactions may promote ovarian tumor stem cells invasion and metastasis,in ovarian tumor growth and metastasis plays an important role in the process.

Ovarian cancer stem cells;CXCL12;CXCR4;CAOV-3;Invasion and metastasis

R737.31

A

1674-4721（2012）06（a）-0010-03

安徽省2010年度第四批科技計劃項目（10020503083）。

李青（1970-），男，在讀博士，副主任醫(yī)師。

2012-05-14 本文編輯：馬 雙）