王 玉，關(guān)瑞章，黎中寶，林 鵬，郭松林

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門361021;2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建廈門361021)

鰻鱺病原性氣單胞菌AFLP分型研究

王 玉1，2，關(guān)瑞章1，2，黎中寶1，2，林 鵬1，2，郭松林1，2

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建廈門361021;2.鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心，福建廈門361021)

以32株從養(yǎng)殖鰻鱺分離的病原性氣單胞菌為試驗(yàn)材料，采用Biolog自動(dòng)菌鑒系統(tǒng)對其進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果表明，有20株被鑒定為嗜水氣單胞菌，7株被鑒定為威隆氣單胞菌，1株為豚鼠氣單胞菌，其余4株未能鑒定到種.為進(jìn)一步確定20株嗜水氣單胞菌和7株威隆氣單胞菌的基因型，篩選了2對引物 (E－C/M－C，E－C/M－A)分別對這兩個(gè)菌種進(jìn)行了AFLP分析.結(jié)果表明:20株嗜水氣單胞菌中共檢測到88個(gè)位點(diǎn)，均為多態(tài)性位點(diǎn);7株威隆氣單胞菌中共檢測到61個(gè)位點(diǎn)，其中60個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn).經(jīng)UPGMA聚類分析表明:20株嗜水氣單胞菌可初步分為3種類型，每種類型之間平均遺傳距離為0.449，同一類型內(nèi)不同菌株的平均遺傳距離為0.127;7株威隆氣單胞菌可初步分為4種類型，每種類型之間平均遺傳距離為0.467，變異范圍為0.415～0.525.該結(jié)果為魚類病原菌的DNA分型研究提供了參考.

鰻鱺;氣單胞菌;生化鑒定;AFLP;DNA分型

0 引言

鰻鱺(Anguilla)是我國最重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類之一，細(xì)菌性疾病嚴(yán)重危害鰻鱺養(yǎng)殖，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失.因此，鰻鱺病原菌的研究一直是其疾病防治研究的基礎(chǔ).已經(jīng)在鰻鱺患病個(gè)體中分離到多種病原菌，包括嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)、遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、鰻弧菌(Vibrio Anguillarum)等［1－3］.目前，病原菌的分類主要包括表型和基因型兩種，前者主要從細(xì)菌形態(tài)［4］、生理生化［5－7］和免疫學(xué)特點(diǎn)［8］進(jìn)行分類，但由于表型對環(huán)境較為敏感，故常有形態(tài)變化與生化特征不穩(wěn)定的現(xiàn)象［3］.近年來，細(xì)菌的基因分型研究變得越來越重要，特別在菌種與亞種的區(qū)分方面具有顯著的優(yōu)勢，包括采用基因雜交、功能基因測序、同工酶、選擇性擴(kuò)增片段多態(tài)性 (AFLP)、微衛(wèi)星等方法［9－12］.由于AFLP技術(shù)具有多態(tài)性豐富、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于細(xì)菌遺傳多樣性分析［13］、分類鑒定［14－15］和DNA分型研究［16］.近10年來，本課題組從不同養(yǎng)殖區(qū)的發(fā)病鰻鱺不同臟器中分離到大量的致病性氣單胞菌，其中大部分被生化鑒定為嗜水氣單胞菌和威隆氣單胞菌，由于同種病原菌的生化鑒定指標(biāo)和血清型等有時(shí)存在較大的差異［3］，故有必要對其進(jìn)行DNA分型，以期為鰻鱺以及魚類病原菌的分類建立一種更為可靠和穩(wěn)定的分型方法.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

32株菌均分離自養(yǎng)殖的美洲鰻鱺(Anguilla rostrata)、歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)和日本鰻鱺(Anguilla Japonica)的發(fā)病部位 (見表1).人工感染實(shí)驗(yàn)表明這些菌株對鰻鱺有不同程度的致病性［3］.

表1 32株病原菌編號(hào)和來源Tab.1 Sources and serial numbers of 32 pathogens isolated from eels

1.2 生化鑒定

采用Biolog全自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng) (GeneⅢ)對32株病原菌進(jìn)行生化鑒定，鑒定結(jié)果包括96個(gè)生理生化指標(biāo).這96個(gè)指標(biāo)為:陰性對照，糊精，D－麥芽糖，D－海藻糖，D－纖維二糖，龍膽，蔗糖，D－Turanose，水蘇糖，陽性對照，pH=6生長，pH=5生長，D－棉籽糖，α－D－乳糖，D－蜜二糖，β－甲基－D－葡萄糖苷，D－水楊甙，N－乙酰－D－氨基葡萄糖，N－乙酰－β－D－甘露糖，N－乙酰－D－半乳糖胺，N－乙酰神經(jīng)氨酸，1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉生長，4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉生長，8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉生長，α－D－葡萄糖，D－甘露糖，D－果糖，D－半乳糖，3－甲基葡萄糖，D－巖藻糖，L－巖藻糖，L－鼠李糖，肌苷，1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))乳酸鈉，夫西地酸，D－絲氨酸，山梨醇，D－甘露醇，D－阿拉伯糖醇，肌醇，甘油，D－葡萄糖－6－磷酸，D－果糖－6－磷酸，D－天冬氨酸，D－絲氨酸，Troleandomycin，利福霉素SV，米諾環(huán)素，明膠，甘氨酰－L－脯氨酸，L－丙氨酸，L－精氨酸，L－天冬氨酸，L－谷氨酸，L－組氨酸，L－焦谷氨酸，L－絲氨酸，林可霉素，鹽酸胍，Niaproof 4，果膠，D－半乳糖醛酸，L－Galactonic酸內(nèi)酯，D－葡萄糖酸，D－葡萄糖醛酸，Glucuronamide，粘酸，奎尼酸，D－Saccharic酸，萬古霉素，四氮唑紫，四氮唑藍(lán)，對羥基苯乙酸，甲基丙酮酸，D－乳酸甲酯，L－乳酸，檸檬酸，α－酮戊二酸，D－蘋果酸，L－蘋果酸，溴丁二酸，萘啶酸，氯化鋰，鉀酸鹽，吐溫40，g－氨基Butryric酸，α－羥基丁酸，β－羥基－D，LButyric酸，α－酮丁酸，乙酰乙酸，丙酸，醋酸，甲酸，氨曲南，丁酸鈉，溴酸鈉.

1.3 基因組DNA的提取

菌液經(jīng)24 h培養(yǎng)將其沉淀，然后用試劑盒 (北京百泰克生物技術(shù)有限公司，離心柱型)提取細(xì)菌基因組DNA.獲取的菌株DNA用瓊脂糖電泳檢測，并用紫外分光光度計(jì)測量DNA的OD值，然后統(tǒng)一用超純水稀釋至50 ng/mL，－20℃保存?zhèn)溆?

1.4 AFLP指紋圖譜的構(gòu)建

AFLP實(shí)驗(yàn)方法參照Vos等［17］和黎中寶等［18］的方法，引物人工接頭由上海捷瑞生物工程 (GENEray Biotechnology)有限公司合成.酶切采用Eco RI和MseⅠ雙酶切的方法.酶切產(chǎn)物10 μL與Eco RI和Mse I接頭進(jìn)行連接反應(yīng).預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系20 μL，Eco RI和MseⅠ預(yù)擴(kuò)引物見表2，PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min，(94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min)×20，72℃終延伸10 min，預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋10倍作為選擴(kuò)模板.選擇性擴(kuò)增:PCR反應(yīng)體系 (20 μL)，Eco RI和MseⅠ選擴(kuò)引物.PCR擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min，{94℃變性30 s，65～56℃ (每循環(huán)降0.7℃)退火30 s，72℃延伸1 min}×10，{94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min}×25，72℃終延伸10 min，反應(yīng)產(chǎn)物用0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖電泳檢驗(yàn).選擇性擴(kuò)增使用了4種Eco RI引物和4種MseⅠ引物，共16個(gè)引物組合，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出2對擴(kuò)增帶清晰、條帶數(shù)目適中的引物，分別為E－C/M－A、E－C/M－C.

1.5 數(shù)據(jù)分析

AFLP標(biāo)記是顯性標(biāo)記，將電泳圖譜中擴(kuò)增條帶的有無轉(zhuǎn)化為1，0原始數(shù)據(jù)矩陣，采用MEGA 4.0［19］軟件分別分析20株嗜水氣單胞菌和7株威隆氣單胞菌的遺傳距離，在該MEGA軟件中選用p－distance遺傳距離分析方法構(gòu)建UPGMA聚類圖并進(jìn)行DNA分型.

2 結(jié)果

2.1 病原菌的生化鑒定結(jié)果

采用Biology全自動(dòng)菌鑒系統(tǒng) (GeneⅢ)對32株鰻鱺病原菌的96個(gè)生理生化指標(biāo)進(jìn)行了分析(具體結(jié)果因數(shù)據(jù)過多而無法在本文提供).結(jié)果表明，32株菌被鑒定為4個(gè)菌群，其中28株被生化鑒定為3個(gè)菌種，其余4株菌 (B19、N1、B33、B651)僅鑒定為氣單胞菌屬(Aeromonas sp.).在鑒定到種的28株菌中，有20株嗜水氣單胞菌、7株威隆氣單胞菌和1株豚鼠氣單胞菌 (見表2).

表2 32株鰻鱺病原菌的Biolog全自動(dòng)菌鑒系統(tǒng)(GeneⅢ)鑒定結(jié)果Tab．2 Identified results of 32 Anguill pathogen strains using Biolog GeneⅢ system

2.2 嗜水氣單胞菌的基因分型

采用2對引物 (E－C/M－C，E－C/M－A)對嗜水氣單胞菌進(jìn)行AFLP分析.結(jié)果 (見圖1)表明，20株菌共擴(kuò)增到88個(gè)基因產(chǎn)物，得到88個(gè)位點(diǎn)，均為多態(tài)性位點(diǎn).經(jīng)算術(shù)平均數(shù)非加權(quán)成組配對法 (UPGMA)聚類分析表明，在遺傳距離刻度尺約0.14時(shí) (如圖1箭頭所示)，20株嗜水氣單胞菌可初步分為3個(gè)基因型，其中基因型i在遺傳距離刻度尺約0.08時(shí)，又可細(xì)分為四個(gè)亞型(ia，ib，ic，id).3個(gè)基因型之間平均遺傳距離為0.449，其中基因型i與ii之間遺傳距離為0.304，i與iii之間為0.546，ii與iii之間為0.496.基因型i內(nèi)16株菌的平均遺傳距離為0.170，基因型iii內(nèi)3株菌的平均遺傳距離為0.083.此外，基因型i內(nèi)四個(gè)亞型 (ia，ib，ic，id)之間的平均遺傳距離為0.267，變異范圍在0.172到0.341之間.

2.3 威隆氣單胞菌的基因分型

2對引物 (E－C/M－C，E－C/M－A)對威隆氣單胞菌AFLP分析的結(jié)果見圖2.從7株菌中總共擴(kuò)增到61個(gè)基因產(chǎn)物，得到61個(gè)位點(diǎn)，其中60個(gè)為多態(tài)性位點(diǎn).經(jīng)UPGMA聚類分析表明，在遺傳距離刻度尺約0.16時(shí) (如圖2箭頭所示)，7株威隆氣單胞菌可初步分為4個(gè)基因型.4個(gè)基因型之間平均遺傳距離為0.467，變異范圍為0.415～0.525.

3 討論

3.1 病原性氣單胞菌鰻鱺分離株的生化鑒定與其致病性

氣單胞菌是淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖的常見致病菌，氣單胞菌引起的魚類疾病暴發(fā)通常與環(huán)境條件的改變密切相關(guān)，溫度突變、低溶氧、營養(yǎng)缺乏、體表的真菌或寄生蟲感染都會(huì)增加魚類對該菌的易感性［19］.本研究在前期對51株鰻鱺病原菌進(jìn)行16S rDNA序列分析的基礎(chǔ)上［3，20］，采用Biolog自動(dòng)菌鑒系統(tǒng)(GeneⅢ)對其中被16S rDNA方法鑒定為氣單胞菌屬的32株鰻鱺病原菌進(jìn)行生化鑒定.結(jié)果有20株被鑒定為嗜水氣單胞菌，7株為威隆氣單胞菌，表明這兩種菌為鰻鱺主要的病原菌［3］.嗜水氣單胞菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的病原菌之一，該菌能引起鰻鱺、草魚和黃鱔等魚類患?。?1－22］，引起的鰻鱺癥狀主要為敗血癥、體表潰爛以及腹水、腸炎等.有研究證實(shí)，不同氣單胞菌引起的鰻鱺癥狀存在一定的差異，而同種氣單胞菌引起不同種鰻鱺的癥狀差異不顯著［3］.威隆氣單胞菌也普遍存在于淡水、淤泥及土壤中，近年來也可見其引起的水產(chǎn)動(dòng)物患病的報(bào)道.該菌引起鰻鱺發(fā)病后可出現(xiàn)敗血癥和腐皮病等［23］.威隆氣單胞菌還可引起錦鯉和斑點(diǎn)叉尾鰓不同臟器的壞死以及西伯利亞鱘和中華鱉患?。?4－27］.

3.2 鰻鱺源嗜水氣單胞菌和威隆氣單胞菌的DNA分型

GEERT等［12］采用AFLP技術(shù)將102株來自環(huán)境和生物體的氣單胞菌屬細(xì)菌分成13個(gè)基因雜交群，其中嗜水氣單胞菌被明顯分成3個(gè)基因簇，Popoff等［28］也通過DNA雜交發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌可分為3個(gè)群 (HG1、HG2、HG3)，其中的HG2雜交群已被建議命名為獸生氣單胞菌［29］.本研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌鰻鱺源分離株在平均遺傳距離為0.449時(shí)也可初步分為3個(gè)基因型，研究結(jié)果與文獻(xiàn)［12，28－29］結(jié)果一致.值得一提的是，20株嗜水氣單胞菌有1株 (B421)分離自日本鰻鱺，8株(N32、N27、B615、N14、N33、N37、N13、N31)分離自美洲鰻鱺，其余11株分離自歐洲鰻鱺，表明嗜水氣單胞菌i型可感染以上3種養(yǎng)殖鰻鱺，而ii型 (B31)和iii型 (B10、B11、B15)則主要感染歐洲鰻鱺.

目前，未見有關(guān)威隆氣單胞菌DNA分型的報(bào)道.本研究發(fā)現(xiàn)7株威隆氣單胞菌鰻鱺源分離株在平均遺傳距離為0.467時(shí)可初步分為4個(gè)基因型，其中基因型1的3株菌有2株分離自歐洲鰻鱺，1株分離自美洲鰻鱺;基因型2的2株菌分別分離自歐洲鰻鱺和日本鰻鱺;基因型3和4的2株菌分別分離自歐洲鰻鱺和美洲鰻鱺，以上結(jié)果表明威隆氣單胞菌也可感染3種養(yǎng)殖鰻鱺.由于威隆氣單胞菌的分離株較少，尚不明確基因型與感染鰻鱺種類之間的關(guān)系，有待于進(jìn)一步研究確定.

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(責(zé)任編輯 朱雪蓮 英文審校 曹敏杰)

DNA Fingerprint Typing Analysis by AFLP for Pathogenic Aeromonas sp．Isolated from Diseased Eels

WANG Yu1，2，GUAN Rui－zhang1，2，LI Zhong－bao1，2，LIN Peng1，2，GUO Song－lin1，2
(1.Fisheries College，Jimei University，Xiamen 361021，China;2.Engineering Research Center of Eel Industrial Technology，Ministry of Education，Xiamen 361021，China)

Thirty－two pathogens isolated from diseased eels and classified as the genus of Aromonas sp.were further identified by an automatic biochemical identification system of Biolog.The results showed that 20 pathogens were identified as Aromonas hyplrophila，7 pathogehs were Aromonas veronii，and 1 pathogen was Aromonas caviae，respectively.Another 4 strains were identified as the genus of Aromonas.The 20 strains of Aromonas hydrophila and 7 strains of Aromonas veronii were then analyzed by Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP)to ascertain the DNA finger typing.The results showed that 88 loci were amplified by two pairs of primers(E－C/M－C and E－C/M－A)with all polymorphic loci in Aromonas hydrophila and 61 loci were amplified by the same primers with 60 polymorphic loci in Aromonas veronii.The UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean Analysis)dendrogram showed that 20 strains of Aromonas hydrophila and 7 strains of Aromonas veronii can be primarily divided into 3 and 4 DNA finger typing respectively.The average distance of gene diversity between and in 3 DNA finger typing of Aromonas hydrophila was 0.449 and 0.127 respectively.The average distance of gene diversity between 4 DNA finger typing of Aromonas veroniiwas 0.467 and ranged from 0.415 to 0.525.The research provided a new technology for the DNA finger typing of fish pathogens.

eels;Aeromonas sp.;biochemistry identification;AFLP;DNA fingerprint typing

S 941.4;Q 7

A

1007－7405(2012)04－0253－06

2012－04－09

2012－05－30

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (31001136);福建省教育廳資助省屬高校科研專項(xiàng) (JK2011029);福建省教育廳基金項(xiàng)目 (JA10191);福建省科技重點(diǎn)項(xiàng)目 (2010N0022);福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (2010J01214)

王玉 (1987—)，男，碩士生，從事魚類病原菌相關(guān)的分子生物學(xué)研究.通訊作者:郭松林(1976—)，男，副教授，碩導(dǎo)，從事魚類病原菌分類與魚病免疫防治研究.