隋班良，蔡明夷，2，劉 穎，2，王志勇，2

(1．集美大學水產學院，福建廈門361021;2．農業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建廈門361021)

黃姑魚♀與大黃魚♂雜交試驗與AFLP分析

隋班良1，蔡明夷1，2，劉 穎1，2，王志勇1，2

(1．集美大學水產學院，福建廈門361021;2．農業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建廈門361021)

開展了黃姑魚♀與大黃魚♂雜交試驗，并對雜交F1初孵仔魚進行了AFLP分析．黃姑魚♀與大黃魚♂雜交能夠正常受精，雜交受精率為93.54%，受精卵正常發(fā)育、孵化，孵化率為86.23%，但仔魚在開口后一周內全部死亡．利用8對選擇性擴增引物組合對親本和雜交后代 (家系)初孵仔魚進行AFLP分析，共得到456個條帶，其中母本特異條帶 (Female Special Band，F(xiàn)SB)178條、父本特異條帶 (Male Special Band，MSB)187條、雙親共有條帶 (Mutual Band，MuB)91條．且其中84條 (47.2%)FSB、89條 (47.6%)MSB和75條 (82.4%)MuB為全部雜交仔魚共有，其余94條 (52.8%)FSB、98條(52.4%)MSB和16條 (17.6%)MuB在雜交后代中發(fā)生了分離．分離的FSB和MSB中分別有33.0%和28.6%表現(xiàn)為偏分離．AFLP分析結果表明，黃姑魚♀與大黃魚♂雜交的初孵仔魚含有雙親的條帶，是真正的雜交種，是構建大黃魚與黃姑魚遺傳圖譜以及研究雜種在細胞和分子水平隔離機制的適合材料．

黃姑魚;大黃魚;AFLP;遠緣雜交;初孵仔魚

0 引言

遠源雜交作為魚類育種的基本手段之一，在雜種優(yōu)勢利用［1－2］、抗逆性能選育［3－5］、多倍體育種［6－8］、誘導雌核發(fā)育［9－11］等領域發(fā)揮了重要作用．黃姑魚(Nibea albiflora)屬石首魚科 (Sciaenidae)，黃姑魚屬(Nibea)，是我國重要的海水經濟魚類［12］，近年來在浙江、福建的養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大．而大黃魚(Larimichthys crocea)屬石首魚科，黃魚屬(Larimichthys)，是我國最重要的海水養(yǎng)殖魚類之一［13］．雖然黃姑魚與大黃魚繁殖季節(jié)重疊，但在海區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)自然雜交種．劉穎等［14］開展了大黃魚♀與黃姑魚♂人工雜交試驗，發(fā)現(xiàn)雜交F1受精率高但成活率低，在初孵仔魚階段含有雙親基因．大黃魚♀與黃姑魚♂雜交F1和異源三倍體已初步應用于大黃魚遺傳圖譜構建和著絲粒作圖中［15］．然而，黃姑魚♀與大黃魚♂雜交的研究目前尚未見報道．因此，本文擬開展黃姑魚♀與大黃魚♂雜交試驗，并用AFLP分析了雜交F1初孵仔魚的遺傳組成，以期為黃姑魚♀與大黃魚♂種間雜交F1的開發(fā)利用提供科學依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗大黃魚和黃姑魚選自福建寧德三都澳海區(qū)網(wǎng)箱中養(yǎng)殖2周齡的候選親本群體，從中挑選出體形正常、性腺發(fā)育良好、體表無外傷的雌魚各3尾、雄魚各2尾，注射LRH－A3進行人工催產，雄魚催產劑量為0.5μg/kg，雌魚為1μg/kg．達到效應時間后采用人工擠取精卵的方法進行干法授精，大黃魚和黃姑魚分別有2尾擠出的卵質量較好，分成2份，比較多的一部分用于異種雜交，少部分用于自繁對照．剪取雌、雄親魚少許胸鰭固定于體積分數(shù)為95%的乙醇中，用于后續(xù)的分子標記分析．各組仔魚孵出后，視桶內魚的數(shù)量取一定數(shù)量仔魚固定于體積分數(shù)為95%的乙醇中，用于AFLP分析．為方便記錄，將黃姑魚♀與大黃魚♂雜交家系記為NL，黃姑魚母本記為NF，大黃魚父本記為LM．

1.2 實驗方法

1)DNA的提取 親魚 (胸鰭)和仔魚 (整尾)基因組DNA的提取均用傳統(tǒng)的蛋白酶K－苯酚/氯仿抽提方法［14］．對提取的DNA樣品先進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA的完整度．用紫外分光光度計測定DNA的OD260與OD280值，計算出DNA原液的濃度，然后取出適量原液稀釋到50 ng/μL，保存于4℃?zhèn)溆?，DNA原液置于－20℃保存．

2)AFLP分析 AFLP反應以及產物銀染顯色等按照Wang［16］等描述的程序進行．實驗中使用的接頭、預擴增引物、選擇性擴增引物均由Invitrogen公司合成，選擇性擴增引物序列為E－AAG/MCAG、E－AGG/M－CTG、E－AAG/M－CTC、E－AGG/M－CTC、E－AAC/M－CAG、E－ACC/MCAA、E－AAG/M－CAA和E－AGG/M－CAA，其中E－代表GACTGCGTACCAATTC，M－代表GATGAGTCCTGAGTAA．AFLP擴增產物使用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結合銀染法檢測．

3)數(shù)據(jù)處理 以1和0代表擴增片段的有或無，將擴增獲得的指紋圖譜轉換成數(shù)字矩陣，利用AFLP AnalyzerVer.1.3程序［17］計算雌雄親本共有條帶和特有條帶、家系個體間、子代個體與親本間的相似系數(shù)和遺傳距離，根據(jù)遺傳距離用UPGMA軟件構建聚類圖．其公式如下:相似系數(shù)Sij=2 Nij/(Ni+Nj)，其中Nij為個體i與j共有的片段數(shù)量，Ni、Nj分別表示i個體與j個體各自具有的片段數(shù)量;遺傳距離D=－Ln S，其中S表示相似系數(shù)．對在子代中發(fā)生分離的標記，用卡方檢驗檢測該標記的分離是否符合孟德爾分離定律．

2 結果

2.1 受精率、孵化率和仔魚畸形率

雜交家系(NL)與對照組(黃姑魚自繁家系NN、大黃魚自繁家系LL)的受精率、孵化率、畸形率見表1，雜交家系的受精率與對照組相當，孵化率略高于對照組，畸形率明顯高于對照組．兩個雜交家系仔魚在孵出后逐漸死亡，1周齡時已死亡殆盡，成活率為0;對照組則正常存活和生長．

2.2 AFLP標記分析

由于2個黃姑魚♀×大黃魚♂雜交組受精卵及仔魚發(fā)育與成活的情況基本一致，因此AFLP實驗只取其中仔魚較多的一組．采用8對引物組合對雜交家系NL(n=32)初孵仔魚及其親本進行擴增，得到456個不同遷移率的條帶．其中，母本特異條帶 (FSB)178條，父本特異條帶 (MSB)187條，雙親的條帶全部出現(xiàn)在子代中，未出現(xiàn)非親條帶(見表2，圖1)．

2.3 AFLP標記在雜交F1仔魚中的傳遞與分離

AFLP條帶在雜交家系中的傳遞與分離如表3所示．親本所擴增出的父本特異條帶 (MSB)、母本特異條帶 (FSB)和共有條帶 (MuB)在子代中都有檢測到．84條 (47.2%)FSB、89條(47.6%)MSB和75條 (82.4%)MuB傳遞給全部雜交后代，94條 (52.8%)FSB、98條(52.4%)MSB和16條 (17.6%)MuB在雜交子代中分離．分離的FSB和MSB中分別有33.0%和28.6%表現(xiàn)為偏分離．NL中FSB和MSB分離位點的平均顯性表型頻率分別為 (0.62±0.18)和(0.55±0.19)．

表1 雜交家系和對照組的受精率、孵化率、畸形率Tab．1 Fertilization rate，hatching rate，aberration rate and survival rate of the hybrid and control family

表2 8對引物在NL雜交家系中擴增出的各種條帶數(shù)Tab.2 Numbers of amplified bands with 8 sets of selective AFLP primers in the NL hybrid family條No．

表3 AFLP標記在雜交家系NL中的傳遞與分離Tab.3 Inheritance and segregation pattern of AFLP markers in the hybrid F1 of N.albiflora(♀)×L.crocea(♂)

2.4 遺傳距離與相似系數(shù)分析

根據(jù)AFLP條帶轉化的數(shù)字矩陣，計算得到母本、父本和子代之間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離(見表4)．雜交家系中，父母本之間的遺傳距離為1.100;雜交后代與母本之間的平均遺傳距離為0.341，與父本之間的平均遺傳距離為0.353．用UPGMA方法構建的聚類關系圖 (見圖2)顯示，所有子代個體先聚類為一個相互間遺傳距離較小的分支，然后與黃姑魚母本聚合，最后再與大黃魚父本聚合．顯示所有雜交子代個體與母本的遺傳相似度均略大于其與父本的遺傳相似度．

表4 黃姑魚♀×大黃魚♂家系F1與親本間的平均遺傳距離 (上三角)和平均相似系數(shù) (下三角)Tab.4 The average genetic distance(above diagonal)and genetic similarity(below diagonal)between F1 and their parents in the hybrid family of N．albiflora(♀)× L．crocea(♂)

3 討論

由于“種間隔離”機制的存在，遠源雜交常會發(fā)生雜交不受精、雜種不活、雜種不育等多種情況［18］．由于遠源雜交的復雜性，兩種魚正反交的結果也可能不同，如草魚♀與三角魴♂雜交時可以得到雜交苗，而三角魴♀與草魚♂雜交很難得到后代［7］．本研究中，黃姑魚♀與大黃魚♂的雜交后代的受精率、孵化率都與自繁對照組相當，黃姑魚♀與大黃魚♂可以正常地進行精卵結合與孵化，沒有出現(xiàn)配子不親和的現(xiàn)象，這與大黃魚♀與黃姑魚♂的雜交結果［14］相似．黃姑魚♀與大黃魚♂雜交仔魚在開口后1周內全部死亡，表現(xiàn)出雜種不活的現(xiàn)象，這與文獻 ［14］的結果也很相似．雜交子代在早期發(fā)育階段成活率低下的現(xiàn)象在其他魚類的雜交中也比較常見，如大黃魚♀與黃姑魚♂雜交、狀黃姑魚♀與大黃魚♂雜交、大黃魚♀與狀黃姑魚♂等雜交F1的早期成活率都在0.5%以下［9，14，19］．雜種不活的可能機制包括:染色體數(shù)目配對和分離紊亂、酶的基因座位或表達的時空順序不同、核質不相容等［18］．黃姑魚♀與大黃魚♂的雜交F1無法存活的具體原因有待于進一步研究．

本研究中，8對AFLP引物共計擴出456個條帶，其中父本特有條帶 (MSB)187條，母本特有條帶 (FSB)178條，父母本共有條帶 (MuB)僅為91條，由此顯示出，黃姑魚與大黃魚的AFLP指紋圖譜存在較大差異;在雙親中檢測到的擴增條帶，可以全部在雜交子代中檢測到，其中有84條 (47.2%)FSB，89條 (47.6%)MSB和75條(82.4%)MuB傳遞給全部雜交后代，說明子代同時含有父母本的基因組，為真正的雜交種．對子代與親本遺傳距離的進一步分析表明，子代與母本的遺傳距離為0.341，與父本的遺傳距離為0.353，顯示子代在遺傳上略偏向母本．本研究中FSB與MSB分離位點的平均顯性表型頻率沒有顯著差異，說明父母本的基因組都沒有選擇性的丟失，故出現(xiàn)這種遺傳上偏向母本的情況可能與雜交子代只擁有母本的線粒體基因組有關．

AFLP標記是顯性標記，本研究在親本中檢測到的條帶中有 94條 (52.8%)FSB、98條(52.4%)MSB和16條 (17.6%)MuB在雜交子代中發(fā)生分離，表明這些條帶所在位點在親本中處于雜合狀態(tài)．發(fā)生分離的FSB和MSB中，分別有33.0%和28.6%表現(xiàn)為偏分離．在大黃魚♀與黃姑魚♂的雜交中，也出現(xiàn)了一定比率的偏分離情況［14］．AFLP條帶在后代中分離出現(xiàn)一定比率的偏離孟德爾比率的現(xiàn)象在其他魚類、貝類中也比較常見，如虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)［20］、皺紋盤鮑 (Haliotis hannai)［21］、斑點叉尾鮰 (Ictalurus punctatus)［22］、牡蠣 (Crassostrea virginica)［23］、合浦珠母貝 (Pinctada martensii)［24］、尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)［25］．與這些結果相比，黃姑魚♀與大黃魚♂雜交后代的偏分離屬于中等偏上水平．關于出現(xiàn)偏分離的原因，已有多種不同的解釋［26］．本研究檢測的雜交仔魚數(shù)量為32尾，進行隨機減少仔魚數(shù)量的模擬計算發(fā)現(xiàn)，隨著分析的仔魚數(shù)量減少，偏分離的位點比例相應地增加，因此推測本研究中偏分離檢出的位點比例較高與檢測的標本數(shù)還不夠多有關;另外，鑒于在大黃魚SSR分析中發(fā)現(xiàn)有致死基因的存在［27］，因此也不能排除部分位點的偏分離可能是由于致死基因的存在而引起的．

本研究結果顯示，黃姑魚♀與大黃魚♂可以成功受精，得到同時含有雙親基因組的雜交子代，且子代受精率、孵化率與對照組相當．雜交子代在遺傳上偏向母本，但是成活率極低，本研究中雜交F1在孵化后1周內全部死亡．可見，黃姑魚♀與大黃魚♂雜交F1不具有直接應用于生產推廣的潛力，但由于雜交子代同時含有雙親的基因組，雜交胚胎和仔魚等材料仍可用于黃姑魚和大黃魚遺傳連鎖圖譜構建和雜種發(fā)育的隔離機制等基礎研究．

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(責任編輯 朱雪蓮 英文審校 曹敏杰)

Amplified Fragment Length Polymorphism Analysis on Hybrid Family Between Nibea albiflora♀and Larimichthys crocea♂

SUI Ban-liang1，CAI Ming-yi1，2，LIU Ying1，2，WANG Zhi-yong1，2
(1．Fisheries College，Jimei University，Xiamen 361021，China;2．Key Laboratory of Helthy Mariculture for the East China Sea，Ministry of Agriculture，Xiamen 361021，China)

Hybridization experiments between Nibea albiflora♀and Larimichthys crocea♂were carried out．The average fertilization rate and the hatching rate of the hybrid cross were 93.54%and 86.23%，respectively．However，the hybrids were all dead within one week after hatching．To elucidate the genetic composition of the hybrids，32 larvae from a hybrid family(NL)was investigated by using AFLP technology．Totally，456 AFLP bands were detected in parents and progenies，which included 178 female parent－ specific bands(FSB)，187 male parent specific bands(MSB)and 91 mutual bands(MuB)．All of the fragments were detected in the hybrid progenies，including 84(47.2%)FSB，89(47.6%)MSB and 75(82.4%)MuB．MuB was found in all the progenies，while other bands were segregated in the progenies，with 33.0%of FSB and 28.6%of MSB distorted segregation．The AFLP results suggested that the larvae of N.albiflora♀ ×L.crocea♂were the true hybrids containing whole nuclear genome of both parents，so theyare applicable to construct the genetic maps of female N.albiflora and that of male L.crocea．

Nibea albiflora;Larimichthys crocea;AFLP;hybridization;larva

S 961.2

A

1007－7405(2012)04－0241－06

2012－04－05

2012－05－21

公益性行業(yè) (農業(yè))科研專項 (200903046－05);福建省自然基金面上項目 (2011J01229);集美大學創(chuàng)新團隊基金 (2010A002)

隋班良 (1986—)，男，碩士生，從事遺傳育種與水產生物技術研究．通訊作者:王志勇(1963—)，男，教授，博導，E-mail:zywang@jmu．edu．cn