高建明 Erle S.Robertson

1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，湖北宜昌 443002；2.美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，賓夕法尼亞費(fèi)城 19104

卡波氏肉瘤病毒（Kaposis'sSarcoma-AssociatedHerpesvirus，KSHV）發(fā)現(xiàn)于1994年，又稱γ-皰疹病毒8型。該病毒是卡波氏肉瘤（Kaposis's Sarcoma）、原發(fā)性滲出性淋巴瘤（primary effusion lymphoa，PEL）、多中心卡氏?。╩ulticentric Castleman's diease）的病原體[1]。KSHV病毒基因組呈雙鏈DNA，有兩種不同的生活周期：潛伏性感染（lantent infection）與裂解性復(fù)制（lytic replication）。這兩種感染方式存在反饋性調(diào)節(jié)并可以相互轉(zhuǎn)化[2-3]。在潛伏性感染時，病毒以游離體的形式存在，只表達(dá) ORF73、K12、ORF72、ORF71、K15 等少數(shù)潛伏性基因，有利于建立持久性的感染[4]。在缺氧或TPA誘導(dǎo)等因素作用下病毒呈裂解性感染，以級聯(lián)反應(yīng)的形式激活一系列病毒編碼基因，并導(dǎo)致宿主細(xì)胞的死亡及病毒子的釋放，傳播至新的宿主細(xì)胞[5-6]。

KSHV復(fù)制轉(zhuǎn)錄激活因子（replication and transcription activator，RTA）是ORF50編碼的一種即刻早期蛋白，是促使病毒從潛伏性感染向裂解性感染轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵調(diào)控因子。無論是外源性還是內(nèi)源性來源引起的RTA表達(dá)增高，均可介導(dǎo)病毒裂解性基因的級聯(lián)表達(dá)[7]。一些化學(xué)物質(zhì)如TPA、butyrate等可誘導(dǎo)KSHV的溶解性感染[8]。KSHV陽性細(xì)胞經(jīng)TPA誘導(dǎo)后1 h就可檢出RTA的表達(dá)[9]。通過Blast比對，筆者發(fā)現(xiàn)抗凋亡基因Bcl-2的P1啟動子上游區(qū)域含有9個CCN9GG樣序列，這里N可以為任何堿基。這些CCN9GG樣序列為近年來新發(fā)現(xiàn)的RTA反應(yīng)元件 （RTA responsive elements，RREs）[10]。KSHV RTA能否與這些RRE相互作用并調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞Bcl-2基因表達(dá)？這引起了研究者的極大興趣。本研究主要探討KSHV RTA上調(diào)宿主Bcl-2的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒

pcDNA-RTA編碼全長RTA的真核表達(dá)載體。pGL3-Bcl-2為含Bcl-2基因全長啟動子的熒光素酶報告質(zhì)粒。pGL3-△RREs，pGL3-△P1，pGL3-△P2是采用 PCR 定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建的報告質(zhì)粒（引物見表1），它們分別突變了Bcl-2基因全長啟動子中的9個RRE、啟動子P1與啟動子P2。構(gòu)建pGL3-△RREs時，將PCR擴(kuò)增片段（Bcl-2啟動子核苷酸-1563～+1）插入pGL3載體SmaI/HindⅢ雙酶切位點(diǎn)處；構(gòu)建pGL3-△P2時，將啟動子片段（-2744～-680）插入pGL3載體SmaI/HindⅢ雙酶切位點(diǎn)處；構(gòu)建pGL3-△P1時，先將啟動子片段（-346～+1）插入pGL3載體MluI/HindⅢ雙酶切位點(diǎn)處（pGL3-P2），再將片段（核苷酸-2867～-1545）插入 pGL3-P2的MluI/HindⅢ雙酶切位點(diǎn)處。

1.2 抗體與細(xì)胞

RTA抗體用雜交瘤技術(shù)制備，由上海巴斯德研究所藍(lán)柯實(shí)驗(yàn)室提供。Bcl-2小鼠單克隆抗體購自Santa Cruz公司，GAPDH抗體為Novus Biologicals公司產(chǎn)品，耦聯(lián)IR Dye 800的羊抗鼠IgG購自Rockland公司。

HEK 293是原代人胚腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染腺病毒DNA的永生化細(xì)胞。BJAB為KSHV和EBVA均陰性的B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系，DG-75為未感染KSHV的Burkitt's淋巴瘤細(xì)胞。BC3和BCBL1是感染KSHV的人體腔淋巴瘤細(xì)胞系。細(xì)胞培養(yǎng)的方法參見有關(guān)文獻(xiàn)[11]。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及KSHV的誘導(dǎo)

采用Bio-Rad公司的Gene Pulser電穿孔儀進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，電穿孔轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)方法在文獻(xiàn)中已有介紹[12]。用20 ng/mL TPA、1.5 mM butyrate誘導(dǎo)KSHV，未經(jīng)誘導(dǎo)處理的細(xì)胞作為對照組。所有細(xì)胞均在誘導(dǎo)后培養(yǎng)48 h收集。

1.4 Western blot

細(xì)胞收集后加入RIPA緩沖液裂解，用Bradford比色法測定蛋白質(zhì)濃度。取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液上樣，聚丙烯胺凝膠電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)移蛋白樣品至PVDF膜，分別用Bcl-2抗體、RTA抗體、GAPDH抗體及耦聯(lián)IR Dye 800的羊抗鼠IgG二抗進(jìn)行免疫印跡。用Odyssey紅外線成像系統(tǒng)（LI-COR公司）觀察結(jié)果。

1.5 RT-PCR

TRIzol（Invitrogen）法抽提細(xì)胞總 RNA，用高容量RNA-to-cDNA試劑盒（Applied Biosystems）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR green實(shí)時PCR試劑盒（Applied Biosystems）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Bcl-2和GAPDH的引物見表1。10 μL反應(yīng)體系含5 μL Master Mix，5 μm 的引物 1 μL，4 μL 稀釋的 cDNA。反應(yīng)條件為：95℃變性 5 min 后 95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30 個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采集與分析使用StepOnePlus實(shí)時PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems）。

表1 PCR擴(kuò)增及報告質(zhì)粒構(gòu)建的引物序列

1.6 熒光素酶報告基因試驗(yàn)

107個 HEK 293細(xì)胞、DG75細(xì)胞共轉(zhuǎn)染10 μg熒光素酶報告質(zhì)粒和 0、5、10、15、20 μg RTA 表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后 24 h收獲細(xì)胞，制備細(xì)胞裂解液。向40 μL細(xì)胞裂解液中加入25 μL熒光素酶試驗(yàn)底物，使用LmaxⅡ384熒光光度計（Molecular Devices）檢測熒光水平。結(jié)果以3次試驗(yàn)值的均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差表示。Western blot用來驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的蛋白質(zhì)的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA-RTA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293、DG75細(xì)胞后，Bcl-2表達(dá)水平上調(diào)

pcDNA-RTA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HEK 293、DG75細(xì)胞 24 h后，Bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著增高 （圖1）。HEK 293和DG75細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染不同劑量的RTA表達(dá)質(zhì)粒，抽提細(xì)胞總RNA用于RT-PCR分析。結(jié)果表明RTA能夠上調(diào)Bcl-2轉(zhuǎn)錄本的水平，而且具有劑量效應(yīng)關(guān)系（圖1A）。Western blot也進(jìn)一步證實(shí)RTA能夠上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平（圖1B）。

2.2 KSHV陽性的BC3、BCBL1細(xì)胞經(jīng) TPA誘導(dǎo)后，Bcl-2表達(dá)水平上調(diào)

應(yīng)用 RT-PCR和Western blot對 TPA誘導(dǎo)后的 BC3、BCBL1細(xì)胞Bcl-2表達(dá)水平的變化進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示Bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著增高（圖2）。未經(jīng)誘導(dǎo)的BC3、BCBL1細(xì)胞不表達(dá)RTA蛋白，而KSHV陰性的BJAB細(xì)胞無論誘導(dǎo)或未誘導(dǎo)均不表達(dá)RTA，兩者Bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平也無差異。

2.3 RTA上調(diào)Bcl-2基因啟動子活性

為研究RTA對Bcl-2啟動子活性的調(diào)節(jié)作用，HEK 293、DG75細(xì)胞共轉(zhuǎn)染10 μg全長Bcl-2啟動子報告質(zhì)粒和不同劑量的RTA表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h收獲細(xì)胞，制備細(xì)胞裂解液，進(jìn)行熒光素酶報告基因檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RTA能夠特異性地上調(diào)Bcl-2基因啟動子活性 （圖3）。當(dāng)RTA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量從5 μg漸增至20 μg時，HEK 293細(xì)胞的Bcl-2啟動子活性增加12～35倍（圖3A）；DG75細(xì)胞Bcl-2啟動子活性增加5～25倍（圖3B）。

2.4 P2啟動子和CCN9GG樣序列對RTA上調(diào)Bcl-2啟動子活性具有重要作用

Bcl-2基因人有兩個啟動子，分別稱為啟動子1（promoter1，P1）和啟動子 2（promoter2，P2）。 P1位于起始密碼子上游約1.4kb處，沒有典型的TATA盒，富含能被Sp-1結(jié)合的GC盒。P2位于起始密碼子上游約80bp處，具有典型的CCAAT盒和TATA盒。在P1上游距起始密碼子1.6～2.6 kb處有9個CCN9GG樣RTA反應(yīng)元件（圖4A）。為定位Bcl-2全長啟動子中對RTA調(diào)控具有重要作用的順式反應(yīng)元件，應(yīng)用PCR定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建了3個截短的報告質(zhì)粒，命名為：pGL3-△RREs，pGL3-△P1，pGL3-△P2。 它們分別突變了 9個CCN9GG樣序列、P1和P2啟動子。

熒光素酶報告基因檢測顯示，突變P1啟動子對共轉(zhuǎn)染了 pcDNA-RTA和 pGL3-△P1報告質(zhì)粒的 HEK 293、DG75細(xì)胞啟動子活性并無影響（圖4B、C），與全長啟動子的活性相似（圖3）。一旦突變P2啟動子或9個CCN9GG樣RREs，均導(dǎo)致共轉(zhuǎn)染了pcDNA-RTA和報告質(zhì)粒的HEK 293、DG75細(xì)胞啟動子活性幾乎完全關(guān)閉，與只轉(zhuǎn)染報告質(zhì)粒而無RTA表達(dá)時啟動子活性相似（圖4B、C）。上述結(jié)果充分說明P2啟動子和9個CCN9GG樣RREs對RTA調(diào)控Bcl-2表達(dá)具有重要作用。

3 討論

病毒感染與細(xì)胞凋亡有密切的聯(lián)系。感染細(xì)胞的凋亡可以限制病毒的復(fù)制，是機(jī)體一種抗病毒的防御機(jī)制。相應(yīng)地，病毒為了在宿主體內(nèi)長期生存，可通過多種途徑干擾機(jī)體介導(dǎo)的感染細(xì)胞的凋亡，以利于病毒自身的生存與擴(kuò)散[13-14]。Bcl-2蛋白是一種定位于線粒體上的膜蛋白，為Bcl-2原癌基因所編碼，具有抑制細(xì)胞凋亡的功能[15-16]。Bcl-2基因在許多腫瘤細(xì)胞都高表達(dá)，不僅阻止腫瘤細(xì)胞凋亡，而且是腫瘤化療、放療不敏感的重要原因[17]。本研究證實(shí)KSHV RTA上調(diào)宿主細(xì)胞Bcl-2表達(dá)。在RTA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞、TPA誘導(dǎo)的KSHV陽性細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著增高。RTA可直接激活Bcl-2基因啟動子，這種激活作用呈劑量依賴性，無細(xì)胞選擇性。

為闡明RTA調(diào)控Bcl-2的分子機(jī)制，對Bcl-2基因啟動子中的作用元件進(jìn)行了鑒定。通過Blast比對發(fā)現(xiàn)Bcl-2的P1啟動子上游區(qū)域含有9個CCN9GG樣序列。這種CCN9GG樣序列為近年來新發(fā)現(xiàn)的RTA作用元件，存在于KSHV的5個基因 ORF57、K2、PAN、MIP和 K12啟動子中[10]。 它在體外與體內(nèi)都與RTA相互作用，并調(diào)節(jié)RTA的反式激活[10]。RTA可能通過與Bcl-2基因啟動子中的CCN9GG樣RRE相互作用上調(diào)其表達(dá)。熒光素酶報告基因檢測顯示，采用定點(diǎn)PCR突變技術(shù)突變Bcl-2基因啟動子的9個CCN9GG樣RRE，導(dǎo)致啟動子活性完全關(guān)閉。因此可以認(rèn)為CCN9GG樣RRE對RTA介導(dǎo)的Bcl-2調(diào)控具有重要的作用。EBV RRE序列GNCCN9GGNG與KSHV RRE具有高度的一致性[18]，另一項(xiàng)有關(guān)EBV RRE的研究指出，由于N9的堿基變化，CCN9GG樣RRE對RTA調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄、病毒的激活存在反應(yīng)性差異[19]。KSHV亦是如此，PAN的RRE與RTA的相互作用強(qiáng)于K2、K12的RRE[20]。一些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)在CCN9GG樣RRE附近，它們可與RTA間接結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用。RTA既可與CCN9GG樣RRE結(jié)合，也可與已經(jīng)結(jié)合到順式作用元件的轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，發(fā)揮對靶基因啟動子活性的最佳調(diào)節(jié)。

P2啟動子為RTA調(diào)控Bcl-2所必需。突變P1后啟動子活性并無降低，與Bcl-2全長啟動子的活性相似；而突變P2會導(dǎo)致啟動子活性顯著降低。P2啟動子具有典型的CCAAT盒和TATA盒；P1啟動子富含能被Sp-1結(jié)合的GC盒，沒有典型的TATA盒[21]。這可能是RTA介導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)上調(diào)對P2啟動子具有選擇性的原因。

綜上所述，KSHV RTA能夠上調(diào)宿主細(xì)胞Bcl-2表達(dá)，CCN9GG樣RTA反應(yīng)元件和P2啟動子對RTA調(diào)控Bcl-2表達(dá)具有重要作用。KSHV RTA介導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)上調(diào)在宿主細(xì)胞增殖與凋亡、病毒子的產(chǎn)生等方面的生物學(xué)意義將在后續(xù)的研究報告中述及。

致謝：衷心感謝 Véronique Bourgarel-Rey（Aix-Marseille Université，Marseille Cedex 05，F(xiàn)rance）提供 Bcl-2 基因全長啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒pGL3-Bcl-2。E.S.R.是美國白血病和淋巴瘤學(xué)會的會員。

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