程明國 沈若武 王守彪 夏玉軍

1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，山東青島 266041；2.青島市第三人民醫(yī)院骨外科，山東青島 266041

骨髓炎是一組細(xì)菌感染骨髓、骨皮質(zhì)和骨膜而引起的炎性疾病。機(jī)體免疫狀態(tài)對骨髓炎的發(fā)生發(fā)展影響很大，一些研究證實(shí)骨髓炎時出現(xiàn)T和B淋巴細(xì)胞功能的障礙[1-2]，而關(guān)于其免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)還有許多不明之處。近年來研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體內(nèi)存在著一群新型的不同于已知的Th17、Th1、Th2和Treg的CD4+Th細(xì)胞亞群，具有分泌IL-9和IL-10的能力，稱之為Th9細(xì)胞[3-4]。目前，尚未見Th9細(xì)胞與骨髓炎有關(guān)的報道。本文旨在通過研究骨髓炎患者局部組織中Th9細(xì)胞效應(yīng)因子IL-9、IL-10的含量，探討Th9細(xì)胞在骨髓炎發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

大耳白兔20只，體重2.2～2.5 kg，雌雄不限，購于山東魯抗醫(yī)藥公司動物中心（許可證號scxk魯20080011）。將動物隨機(jī)分為手術(shù)組（n=10），假手術(shù)組（n=5）和對照組（n=5）。

1.2 主要試劑

IL-9和IL-10單克隆抗體（兔抗鼠），即用型SABC試劑盒等，購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3 建立兔脛骨近端骨髓炎模型

10%水合氯醛（500 mg/kg）腹腔注射麻醉，取仰臥位，無菌條件下取右脛骨髕內(nèi)下縱切口，長約4 cm。切開皮膚、皮下，顯露脛骨近端內(nèi)側(cè)，用3 mm鉆頭的手鉆，在該處鉆3個縱向相連、部分重疊的骨洞。用小刮匙刮除松質(zhì)骨，修整骨洞邊緣，制成一1.0 cm×0.5 cm的矩形骨窗。于骨窗內(nèi)注入5×106CFU/mL金葡球菌0.5 mL及魚肝油酸鈉50 g/L 0.5 mL，10 min后用骨蠟將骨窗封閉，反復(fù)沖洗后縫合傷口[5]，術(shù)后回籠常規(guī)喂養(yǎng)2周后處死。假手術(shù)組僅顯露脛骨，然后關(guān)閉切口。正常對照組不做任何處理。

1.4 HE染色及免疫組織化學(xué)染色觀察

術(shù)后2周腹腔注射麻醉后，在無菌條件下切取兔右脛骨近端骨窗上下約2 cm，縱行剖成兩半后用4%多聚甲醛固定24 h、20%EDTA脫鈣脫鈣、浸蠟包埋、連續(xù)切片。應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC三步法染色，檢測IL-9、IL-10的表達(dá)，DAB顯色，鏡下控制顯色時間。最后脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。

1.5 免疫組化染色結(jié)果分析

細(xì)胞漿內(nèi)黃褐色或棕褐色顆粒即為免疫組化染色陽性結(jié)果。利用德國Sample PCI圖象分析系統(tǒng)對免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行光吸收密度測量分析，將免疫組化染色結(jié)果轉(zhuǎn)化為光吸收密度值進(jìn)行定量分析。每張切片測定5個視野取平均吸光度值，以其作為切片的測定值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

正常對照組及假手術(shù)組骨組織內(nèi)只有少量中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等浸潤，炎癥反應(yīng)不明顯，無壞死區(qū)域。手術(shù)組骨組織內(nèi)可見大量的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的聚集，骨質(zhì)呈灶性壞死及片狀壞死區(qū)，并可見纖維結(jié)締組織增生。

2.2 IL-9、IL-10的免疫組化染色結(jié)果

正常對照組及假手術(shù)組骨組織內(nèi)IL-9、IL-10陽性表達(dá)較弱，而手術(shù)組則呈強(qiáng)陽性表達(dá)，淋巴細(xì)胞漿內(nèi)可見黃褐色或棕褐色顆粒，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；結(jié)果見表1。

表1 各組局部骨組織內(nèi)IL-9、IL-10的免疫組化染色的平均光密度值（±s）

表1 各組局部骨組織內(nèi)IL-9、IL-10的免疫組化染色的平均光密度值（±s）

注：與正常組、假手術(shù)組比較，#P<0.05

組別 例數(shù)（n） IL-9 IL-10正常組假手術(shù)組手術(shù)組5 5 1 0 0.221±0.011 0.315±0.013 1.024±0.313#0.219±0.031 0.268±0.043 1.356±0.487#

3 討論

骨髓炎是目前骨科臨床上較常見的難治性疾病。目前，對骨髓炎的治療措施主要有加強(qiáng)全身營養(yǎng)及大量應(yīng)用抗生素，置管沖洗，適時采用徹底清創(chuàng)取出死骨，局部肌瓣填塞等。然而這些方法都難以取得滿意的療效，許多學(xué)者認(rèn)為，改善局部血供和充分發(fā)揮機(jī)體在局部的免疫功能可能是解決問題的關(guān)鍵[6]。機(jī)體的抗細(xì)菌感染免疫主要依靠T、B淋巴細(xì)胞及相關(guān)輔助細(xì)胞發(fā)揮的適應(yīng)性免疫，所以有關(guān)骨髓炎的免疫調(diào)節(jié)日益受到重視。

Th9細(xì)胞由TGF-β和IL-4誘導(dǎo)，其不同于已知的Th1、Th17、Th2和Treg，是一種能分泌IL-9、IL-10的新型的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞亞群[7]。Th9細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要效應(yīng)因子是IL-9，它通過與各類效應(yīng)性T細(xì)胞或其他細(xì)胞因子的相互作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。IL-9可作用于不同的炎癥細(xì)胞，如T、B淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞，使得炎癥細(xì)胞的數(shù)量增加并分泌一些炎癥介質(zhì)，促進(jìn)炎癥的發(fā)生[8]。此外，IL-9還可作用于組織細(xì)胞，在許多疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[9]。本文研究顯示：骨髓炎的局部骨組織中IL-9的表達(dá)明顯高于正常組，說明IL-9在骨髓炎疾病改變中起到重要的炎性介質(zhì)作用，加速了炎癥病變的進(jìn)展速度，這與目前IL-9在其他組織器官的慢性炎癥中的研究結(jié)果相似。

Th9細(xì)胞除了IL-9這個效應(yīng)因子外，還分泌IL-10。IL-10是一種有效的抗炎因子，在病原微生物的感染中發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)作用，一直以來作為抗炎因子被廣泛關(guān)注。IL-10還可由B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、角化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞及人Th2細(xì)胞分泌產(chǎn)生，并能夠抑制炎性反應(yīng)，限制炎癥的發(fā)展[10]。本文研究顯示骨髓炎的局部骨組織中IL-9的表達(dá)明顯高于正常組，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果相似[11-12]。IL-10在骨髓炎的局部骨組織中的高表達(dá)，可能是因?yàn)闄C(jī)體對維持促炎性細(xì)胞因子與抑炎性細(xì)胞因子之間的平衡做出的自身調(diào)節(jié)。促炎性細(xì)胞因子與抑炎性細(xì)胞因子之間的平衡是維持正常免疫狀態(tài)的基礎(chǔ)，這也說明骨髓炎局部組織中存在著抑制促炎性細(xì)胞因子的過高表達(dá)。

綜上所述，筆者認(rèn)為Th9細(xì)胞在骨髓炎發(fā)病中起到了重要的免疫調(diào)節(jié)作用，雖然IL-10在骨髓炎的局部骨組織中高表達(dá)，但I(xiàn)L-9才是Th9細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要效應(yīng)因子，所以筆者認(rèn)為Th9細(xì)胞在骨髓炎發(fā)病中起到了促進(jìn)炎癥發(fā)生的作用。

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