裴靜嫻，王月剛，張藝軍，賴文巖，吳平生

（1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院心內(nèi)科，廣州 510515；2.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院干部病房二科，廣州 510010）

p53RFP是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)受p53轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因，其產(chǎn)物具有E3泛素連接酶活性，通過泛素化降解凋亡重要啟動(dòng)信號p21WAF1，參與細(xì)胞增殖和凋亡，從而參與細(xì)胞周期的調(diào)控［1～3］。本研究擬構(gòu)建p53RFP的表達(dá)載體，通過觀察其對細(xì)胞生長的影響，初步了解其生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293A細(xì)胞（美國Invitrogen公司），SW620細(xì)胞（本研究室凍存）；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；胎牛血清（德國PAA公司）；pcDNA4/Myc-HisA、LipofectamineTM2000質(zhì)粒中提試劑盒（美國Invitrogen公司），KOD-Plus-Neo（日本Toyobo公司）；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、EcoRⅠ（加拿大Fermentas公司）；T4 連接酶、DNA marker、RNAiso Plus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）；膠回收試劑盒、DNA純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒（美國Biomiga公司）；熒光定量PCR試劑盒（美國Roche公司）；大腸桿菌DH5α為本室凍存菌種；BCA蛋白質(zhì)定量測定試劑盒（上海申能博彩公司）；鼠抗人β-actin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），鼠抗人p53RFP單克隆抗體（臺灣Abnova公司），山羊抗小鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（HRP-labeled goat anti-mouse IgG，北京中杉金橋公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；ECL發(fā)光試劑盒（美國Pierce公司），CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司）。

1.2 方法

1.2.1 p53RFP表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定：37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)SW620細(xì)胞48 h，用RNAiso Plus試劑提取細(xì)胞總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)p53RFP基因CDS區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，引入限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ的識別位點(diǎn)，上游引物：5′CATCTGGACCCCTACCGAACA3′，下游引物：5′ACACGAGCAGAATTTCAGGTG3′。PCR 擴(kuò)增p53RFP編碼序列，反應(yīng)體系為50 μL：10×PCR緩沖液 5 μL，dNTP 5 μL，Mg2+3 μL，上下游引物（10 μmol）各 1.5 μL，cDNA 模板 2 μL，KOD-Plus-Neo 1 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，55 ℃30 s，68℃1 min 20 s，共32個(gè)循環(huán)；68℃延伸 3 min。取PCR純化產(chǎn)物和pcDNA4/Myc-HisA質(zhì)粒分別行HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，回收大片段，加T4連接酶16℃水浴過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于含有100 mg/L氨芐青霉素的LB選擇平板上倒置培養(yǎng)過夜。篩選2～3個(gè)菌落，搖菌后取1 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定；小量提取質(zhì)粒DNA，進(jìn)行HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，將雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒送英駿公司測序。

1.2.2 p53RFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞：以含5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK 293A細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1 d細(xì)胞傳代。將5×105細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合率在80%以上。以O(shè)pti-MEM 250 μL分別稀釋 pcDNA4-p53RFP質(zhì)粒約 5 μg和 10 μL LipofectamineTM2000。轉(zhuǎn)染 4 h 后更換新鮮培養(yǎng)基。

1.2.3 RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染后p53RFPmRNA表達(dá)水平：pcDNA4-p53RFP轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞24 h，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板行PCR，反應(yīng)條件：95 °C 10 min；95 °C 10 s，60 °C，30 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：p53RFP：上游引物5′CATCTGGACCCCTACCGAACA3′，下游引物 5′ACA CGAGCAGAATTTCAGGTG3′；β-actin：上游引物 5′CAAATGCTTCTAGGCGGACTATG3′，下游引物 5′TGCGCAAGTTAGGTTTTGTCA3′。

1.2.4 Western blot檢測轉(zhuǎn)染后p53RFP蛋白表達(dá)水平：pcDNA4-p53RFP轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞48 h，提取細(xì)胞總蛋白。將蛋白加入6×loading buffer，100°C煮沸5 min。取30 μg總蛋白上樣，行12%SDS-PAGE電泳，200 mA 70 min轉(zhuǎn)印至PVDF膜，依次5%脫脂牛奶封閉，一抗（p53RFP 1︰600稀釋，β-actin 1︰1 000稀釋）孵育過夜，TBST漂洗（10 min×3次），二抗（1︰10 000稀釋）室溫孵育1 h，TBST漂洗（10 min×3次），ECL發(fā)光。

1.2.5 細(xì)胞增殖活力檢測（cell couning kit-8，CCK-8）p53RFP過表達(dá)對HEK293A細(xì)胞增殖的影響：接種 HEK293A 細(xì)胞于 6孔板（3×105～4×105/孔），24 h后轉(zhuǎn)染pcDNA4-p53RFP，空載體轉(zhuǎn)染組做陰性對照，空白組不做任何處理。轉(zhuǎn)染4 h后更換為新鮮培養(yǎng)基。12 h后消化為單細(xì)胞懸液，以每孔2 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每組6個(gè)復(fù)孔。于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h 及 96 h，向培養(yǎng)孔加入 10 μL CCK-8 溶液，在培養(yǎng)箱中孵育3 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm的吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用One-way ANOVA檢驗(yàn)比較不同處理組p53RFPmRNA表達(dá)水平，及不同處理組對HEK293A細(xì)胞增殖水平是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且方差齊性時(shí)，采用LSD法行多重比較，方差不齊時(shí)采用Games-Howell檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p53RFP基因克隆

所要擴(kuò)增的p53RFP基因的長度為912 bp，RTPCR的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，條帶大小與理論值一致，表明成功擴(kuò)增出p53RFP基因。見圖1。

2.2 pcDNA4-p53RFP質(zhì)粒酶切及測序鑒定

pcDNA4-p53RFP質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切后，取5 μL酶切產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示：可見載體片段（5.1 kb）和目的片段（912 bp），表明載體連接成功。

2.3 RT-qPCR檢測p53RFPmRNA表達(dá)

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示：pcDNA4-p53RFP轉(zhuǎn)染組p53RFPmRNA相對表達(dá)量（34739.440±1382.572）顯著高于空白組（0.980±0.020）及空載體轉(zhuǎn)染組（0.837±0.101）（P 均<0.01），表明 pcDNA4-p53RFP轉(zhuǎn)染HEK293A后可在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)。

2.4 Western blot檢測p53RFP蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果如圖3所示：pcDNA4-p53RFP轉(zhuǎn)染組p53RFP蛋白表達(dá)水平上調(diào)，提示pcDNA4-p53RFP轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞可大量表達(dá)p53RFP蛋白。

2.5 轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞增殖水平

CCK-8檢測結(jié)果如圖4所示：與陰性對照組相比，pcDNA4-p53RFP轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后72 h、96 h細(xì)胞增殖受到明顯抑制（P均<0.01）。

3 討論

p53RFP是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的重要基因［1］，目前對該基因的研究較少。對其生物學(xué)活性的認(rèn)識主要停留在它作為p53下游靶基因參與的細(xì)胞凋亡過程方面。為研究p53RFP的生物學(xué)功能，本研究成功構(gòu)建了p53RFP的表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染至HEK293A細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染后，p53RFP可在HEK293A細(xì)胞高效表達(dá)，并可抑制HEK293A細(xì)胞的增殖。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，p53RFP作為p53誘導(dǎo)的泛素連接酶，可能通過泛素化降解凋亡的重要啟動(dòng)信號p21WAF1參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)［1］。而p53RFP是否可以直接調(diào)控細(xì)胞周期蛋白，從而影響細(xì)胞增殖，尚有待于進(jìn)一步研究。

泛素—蛋白酶系統(tǒng)在生理及病理生理?xiàng)l件下可發(fā)揮多種重要作用。真核細(xì)胞內(nèi)約80%的蛋白都是通過泛素—蛋白酶系統(tǒng)降解。E3泛素連接酶是泛素—蛋白酶系統(tǒng)特異性的重要成分，決定泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解途徑底物的特異性［4］。大多數(shù)E3泛素連接酶屬于RING結(jié)構(gòu)域家族，其最典型的特點(diǎn)是具有環(huán)指結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)是此家族具有泛素連接酶作用的重要因素。具有環(huán)指結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶參與調(diào)節(jié)很多重要的細(xì)胞功能，如細(xì)胞周期、DNA修復(fù)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及對低氧的反應(yīng)［5～9］。p53RFP包含氮端的RING-IBR-RING結(jié)構(gòu)域和碳端保守結(jié)構(gòu)域，研究發(fā)現(xiàn)氮端的RING-IBR-RING結(jié)構(gòu)域決定其產(chǎn)物具有E3泛素連接酶活性，碳端的保守結(jié)構(gòu)域也可能具有重要的功能［3］。目前，對于p53RFP基因的功能研究較少，p53RFP的功能及其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。因此，本研究構(gòu)建的p53RFP表達(dá)載體為進(jìn)一步研究p53RFP的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

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