于嵩，王玥，王旭

（遼寧中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院解剖組胚教研室，沈陽 110847）

帕金森病 （Parki nson′sdi sease，PD）是一種中樞神經系統的退行性疾病，以黑質部位的多巴胺能神經元變性壞死為主要病理特征。隨著人們生活水平的提高和人口老齡化的加劇，PD已成為第四大致死疾病。因此，解析PD的發(fā)病機制以及尋找神經退行性疾病的治療策略已經成為神經科學領域的一個熱點。

姜黃素為常用傳統中藥，由于其安全性高且毒副作用小，且具有多方面的藥理作用機制，近年來廣泛用于治療神經退行性疾病。本研究采用 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（1-m et hyl-4-phenyl-1，2，3，6-t et rahydropyri dine，M PTP）誘導PD小鼠模型，應用曠場實驗、牽引實驗、免疫組化染色、分析和W est ern bl ot檢測手段，探討姜黃素對多巴胺能神經元的保護作用及其發(fā)生機制，對將來實現姜黃素臨床治療PD提供可靠的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

5月齡雄性C57BL/6小鼠30只，體質量均約25 g，隨機分成3組，對照組、模型組和姜黃素治療組。對照組小鼠正常飲食；模型組小鼠腹腔注射M PTP（30 mg/kg）連續(xù)5 d，間隔24 h；治療組小鼠連續(xù)5 d腹腔注射M PTP（30 mg/kg），隨后連續(xù)7 d腹腔注射姜黃素（50 mg/kg）。

1.2 方法

1.2.1 行為學檢測：曠場實驗根據Teng等［1］的方法，觀察水平運動力和垂直運動力2個指標。牽引實驗根據W ang等［2］的方法記錄牽引評分。

1.2.2 免疫組織化學染色：常規(guī)免疫組化染色實驗方法。

1.2.3 體視學和光密度分析：每只小鼠取腦切片5張，光鏡照相，i pp6.0軟件分析切片上TH和DAT陽性纖維的光密度值和GFAP陽性的細胞數量，以每組50張切片的平均值作為各組的數據。

1.2.4 W est ern bl ot：常規(guī)W est ern bl ot實驗方法。

1.3 統計學分析

應用SPSS 13軟件，One-wayANOVA分析數據，結果以±s表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素改善小鼠的行為學異常

曠場實驗、牽引實驗結果顯示：模型組小鼠的水平運動力、垂直運動力以及牽引評分顯著低于對照組小鼠。姜黃素給藥7 d后，小鼠的水平運動、垂直運動和牽引評分顯著增加。

2.2 姜黃素保護M PTP誘導的多巴胺能神經纖維減少

TH、DAT免疫組化結果顯示：與對照組相比，模型組小鼠中腦紋狀體的多巴胺能神經纖維顯著減少；姜黃素治療組小鼠中腦紋狀體內的陽性神經纖維的數量明顯增加。光密度分析結果顯示：模型組小鼠中腦紋狀體內TH、DAT免疫陽性產物的光密度值分別減少了43%和91%，姜黃素治療組小鼠中腦紋狀體內的TH到DAT標記的陽性纖維光密度分別增加到82%和36%。

2.3 姜黃素對M PTP誘導的星形膠質細胞激活的抑制作用

GFAP免疫組化結果顯示：與對照組小鼠相比，模型組小鼠黑質內星形膠質細胞數量明顯增高，姜黃素治療明顯減少了由M PTP激活的星形膠質細胞的數量（圖1）。體視學結果顯示模型組小鼠黑質內激活的星形膠質細胞數量比對照組小鼠高出2.5倍，而姜黃素干預后星形膠質細胞的數量降到正常對照組小鼠的1.5倍。

2.4 姜黃素對M PTP誘導的腫瘤壞死因子α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）激活的抑制作用

W est ern bl ot結果顯示：M PTP誘發(fā)了小鼠黑質的TNF-α明顯增高，而給予姜黃素治療后，M PTP誘發(fā)的TNF-α的增高得到顯著抑制。

3 討論

流行病學調查表明，印度人每天的飲食中包含約200 mg的姜黃素成份，從而使其PD和阿爾茨海默病的患病率明顯要低于其他國家和地區(qū)。已經有一些研究證實姜黃素的神經保護機制是多方面的［3，4］。在行為學實驗中我們發(fā)現姜黃素治療能夠提高模型組小鼠的水平運動評分、垂直運動評分和牽引評分；TH和DAT免疫組化染色結果則證實姜黃素能保護M PTP誘導的多巴能神經元的減少，這些結果首先驗證了姜黃素具有對PD多巴胺能神經元的保護作用。

我們的W est ern bl ot結果證實小鼠腹腔注射M PTP后使黑質內TNF-α顯著增高。TNF-α主要是由激活的單核/巨噬細胞分泌，是具有多種生物活性的多效細胞因子，主要與炎性反應等有關。同時，GFAP免疫組化染色結果顯示模型小鼠黑質部位GFAP陽性星形膠質細胞的數量顯著高于對照組。研究證實炎癥反應參與了多巴胺能神經元退行性變［5］，而且有文獻報道，星形膠質細胞的激活以及TNF-α的增多可能參與了腦內炎性反應過程［6，7］，因此我們認為增高的TNF-α可以促進星型膠質細胞的激活，從而進一步加重炎性反應。St ri vast ava等［8］報道了姜黃素具有抗炎和抗氧化作用，我們的W est ern bl ot結果顯示了姜黃素均能抑制TNF-α的激活；GFAP免疫組化染色結果證實姜黃素給藥可以減少模型小鼠黑質部位GFAP陽性星形膠質細胞的數量。根據以上結果，我們推測：姜黃素通過減少TNF-α的產生，抑制星形膠質細胞的激活，進而使激活的星形膠質細胞釋放細胞毒性物質減少，最終起到了保護多巴胺能神經元的作用。

［1］Teng X，Sakai T，Liu L，et al.Attenuation of MPTP-induced neurotoxicity and locomotor dysfunction in Nucling-deficient mice via suppression of the apoptosome pathway［J］.J Neurochem，2006，97（3）：1126-1135.

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［4］Tu CT，Han B，Yao QY，et al.Curcumin attenuates Concanavalin A-induced liver injury in mice by inhibition of Toll-like receptor（TLR）2，TLR4 and TLR9 expression ［J］.Int Immunopharmacol，2012，12（1）：151-157.

［5］Vila M，Jackson-Lewis V，Guegan C，et al.The role of glial cells in Parkinson′s disease［J］.Curr Opin Neurol，2001，14（1）：483-489.

［6］劉犇，陳清，郭江，等.白藜蘆醇對脂多糖誘導的星型膠質細胞炎癥損傷的保護作用［J］.南方醫(yī)科大學學報，2011，12（31）：2052.

［7］Megan L，Steele，Stephen R，et al.Reactive astrocytes give neurons less support：implications for Alzheimer′s disease［J］.Neurobiol Aging，2012，33：423.e1-423.e13.

［8］Srivastava RM，Singh S，Dubey SK，et al.Immunomodulatory and therapeutic activity of curcumin［J］.Int Immunopharmacol，2011，11（6）：331-341.