王佐周，劉麗波，薛一雪，劉云會(huì)

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，沈陽 110001；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽 110001；3.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110004）

血腦屏障主要由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基膜和膠質(zhì)細(xì)胞組成，相鄰內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接能夠封閉細(xì)胞間的縫隙，是血腦屏障主要的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)。緊密連接主要由跨膜蛋白o(hù)ccludin、claudins家族、胞質(zhì)附著蛋白ZOs家族及連接黏附分子等成分構(gòu)成，它們的分布、表達(dá)水平以及蛋白之間相互作用的變化對(duì)緊密連接功能的調(diào)節(jié)至關(guān)重要［1］。雖然腫瘤組織部分破壞了血腦屏障，但仍然存在血腫瘤屏障（blood-tumor barrier，BTB），這限制了抗腫瘤藥物進(jìn)入腫瘤組織，嚴(yán)重影響了化療療效［2］。我們前期的研究結(jié)果顯示，內(nèi)皮—單核細(xì)胞激活多肽Ⅱ（endothelial-monocyte activating polypeptide Ⅱ ，EMAP-Ⅱ）能夠通過下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、claudin-5和ZO-1的表達(dá)水平，開放緊密連接，選擇性地增加BTB的通透性，而對(duì)正常血腦屏障沒有影響［3］。研究發(fā)現(xiàn)存在于內(nèi)皮細(xì)胞膜上的α-ATP合酶被認(rèn)為是EMAP-Ⅱ的功能受體，并且腫瘤的酸性環(huán)境使EMAP-Ⅱ與腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的α-ATP合酶的親和力高于它與正常組織血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上α-ATP合酶的親和力［4］，我們的研究證實(shí)EMAP-Ⅱ作用后通過選擇性與腫瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上的α-ATP合酶結(jié)合，發(fā)揮選擇性開放BTB的作用［5］。但EMAP-Ⅱ是否能夠影響occludin和ZO-1的相互作用及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制均不清楚。研究顯示，在調(diào)節(jié)緊密連接的信號(hào)分子中，PKC是調(diào)節(jié)緊密連接動(dòng)態(tài)變化、影響細(xì)胞旁通透性的重要分子［6］。本研究旨在探討EMAP-Ⅱ?qū)o密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的分布、定位和相互作用的影響，并分析其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制，以明確EMAP-Ⅱ開放BTB緊密連接的分子機(jī)制，并為EMAP-Ⅱ的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑和器材：EMAP-Ⅱ、葡聚糖和Ⅱ型膠原酶，購(gòu)于Sigma Chemical公司；DMEM，購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清，購(gòu)自天津H&Y生物公司；兔抗大鼠occludin和小鼠抗大鼠ZO-1抗體，購(gòu)于Cell Signaling公司；TRICT標(biāo)記的山羊抗兔、FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗，購(gòu)于北京中杉公司；PKC活性檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于Calbiochem公司。二氧化碳培養(yǎng)箱（Forma Scientific），購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1FD），購(gòu)于蘇凈集團(tuán)安泰公司；臺(tái)式低溫超速離心機(jī)（3K18），購(gòu)于德國(guó)Sigma公司；酶標(biāo)儀（SpectraMax M5），購(gòu)于美國(guó)MD公司；熒光顯微鏡（Olympus BX51），購(gòu)于日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：隨機(jī)分為7組（每組樣本例數(shù)為6）：模型組、EMAP-Ⅱ 0.5 h 組、EMAP-Ⅱ 1 h 組、EMAP-Ⅱ 2 h 組、EMAP-Ⅱ 3 h 組、EMAP-Ⅱ 6 h 組和EMAP-Ⅱ12 h組。模型組僅給予生理鹽水。

1.2.2 模型建立：取1周內(nèi)的Wistar胎大鼠，無菌條件下取出大腦組織，去除肉眼可見的血管、大腦髓質(zhì)、小腦及軟腦膜，收集大腦皮質(zhì)，勻漿后移入15%葡聚糖溶液中高速離心獲得底部的“微血管層”。加入1 mLⅡ型膠原酶（1 mg/mL），37℃水浴中震蕩消化，微血管段呈現(xiàn)“串珠樣”表現(xiàn)時(shí)終止消化，加入培養(yǎng)液（DMEM培養(yǎng)液，20%熱滅活的胎牛血清）輕柔吹打。用培養(yǎng)液稀釋微血管段至密度為8×103/cm2，種植入1%明膠覆蓋的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，以后每3 d換培養(yǎng)液1次。常規(guī)培養(yǎng)C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞。按Hurst等［7］的方法建立體外BTB模型。先將1×106個(gè)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞消化后接種于transwell微孔膜的反面，加入適量的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至約80%融合后，將1×105個(gè)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（rat brain microvascular endothelial cells，BMEC） 接種于微孔膜正面。共培養(yǎng)約7 d BMEC融合，此后每2 d換培養(yǎng)液1次，共同培養(yǎng)7～10 d后給予EMAP-Ⅱ進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 體外BTB模型跨內(nèi)皮細(xì)胞阻抗（transendothelial electrical resistance，TEER）值的測(cè)量：應(yīng)用密理博公司的Millicell-ERS電阻測(cè)量系統(tǒng)測(cè)量，測(cè)量值與Transwell微孔膜的表面積的乘積為最終的TEER值，用 Ω·cm2表示。

1.2.4 雙重免疫熒光方法檢測(cè)occludin和ZO-1的分布、定位：EMAP-Ⅱ作用不同時(shí)間后，取出transwell膜，剪下多聚酯膜，應(yīng)用多聚甲醛固定，PBS漂洗后，正常血清室溫封閉30 min，加入occludin和ZO-1的抗體混合物（occludin 1∶200稀釋，ZO-1 1∶200稀釋），4℃孵育過夜，而后加入相應(yīng)的FITC和TRITC標(biāo)記的熒光二抗（1∶100稀釋），避光室溫孵育40 min，封片劑封片后在熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5 免疫共沉淀方法檢測(cè)occludin和ZO-1的結(jié)合：EMAP-Ⅱ作用不同時(shí)間后，棄去培養(yǎng)液后用PBS漂洗，應(yīng)用非變性裂解緩沖液提取BMEC細(xì)胞的蛋白提取物，將細(xì)胞裂解物與ZO-1抗體4℃緩慢搖動(dòng)孵育過夜，加入蛋白G微珠孵育4℃緩慢搖動(dòng)4 h，而后4℃離心5 min（3 302 r/min）獲得沉淀，應(yīng)用蛋白裂解液洗滌沉淀3～5次，向沉淀中加入電泳上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，離心后取上清應(yīng)用occludin多克隆抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，分析occludin與ZO-1結(jié)合水平。

1.2.6 PKC活性檢測(cè)：常規(guī)裂解液提取BMEC總蛋白，并進(jìn)行蛋白定量，按照PepTag PKC活性檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行磷酸化反應(yīng)30 min，然后電泳15 min，紫外燈下觀察，電泳后磷酸化與非磷酸化的底物肽C1被分離，磷酸化的底物向正極移動(dòng)，非磷酸化的底物向負(fù)極移動(dòng)。將各組磷酸化條帶按等體積切除（約 250 μL）并加熱熔解，將 125 μL 上述熱瓊脂糖轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有75 μL溶膠液和50 μL冰乙酸的管中?？焖贉u旋振蕩后，轉(zhuǎn)移至96孔板中，在570 nm波長(zhǎng)讀吸光度值。用不含PepTag誖短肽的液態(tài)瓊脂糖做空白清零。PKC的活性單位以每分鐘每毫升蛋白溶液中使底物肽C1磷酸化的納摩爾數(shù)（nmol·min-1·mL-1）表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EMAP-Ⅱ?qū)w外BTB模型TEER值的影響

如表1所示，EMAP-Ⅱ作用后體外BTB模型的TEER值顯著降低，通透性顯著升高。在EMAP-Ⅱ作用0.5 h時(shí)TEER值開始降低，作用1 h時(shí)效果最顯著，而后逐漸升高，在12 h時(shí)基本恢復(fù)至EMAP-Ⅱ作用前水平。

表1 E M A P-Ⅱ?qū)w外B T B模型T E E R和P K C活性的影響T a b.1 E f f e c t o f E M A P-Ⅱo n T E E R a n d P K C a c t i v i t y o f B T B i n v i t r o G r o u p n T E E R P K C a c t i v i t y M o d e l 6 1 5 7.5 6±7.7 5 0.4 3 2±0.0 2 2 E M A P-Ⅱ 0.5 h 6 1 3 4.2 7±6.9 1 1） 0.6 9 5±0.0 3 5 1）E M A P-Ⅱ 1 h 6 1 1 3.4 2±6.0 7 1） 0.9 8 8±0.0 4 2 1）E M A P-Ⅱ 2 h 6 1 2 8.5 9±6.4 3 1） 0.7 9 4±0.0 3 9 1）E M A P-Ⅱ 3 h 6 1 3 9.6 3±7.1 4 2） 0.6 3 6±0.0 3 3 2）E M A P-Ⅱ 6 h 6 1 4 4.4 7±7.3 8 0.5 4 2±0.0 3 1 E M A P-Ⅱ 1 2 h 6 1 5 2.9 1±7.7 9 0.4 7 5±0.0 2 5 1）P<0.0 1 v s m o d e l g r o u p；2）P<0.0 5 v s m o d e l g r o u p.

2.2 EMAP-Ⅱ?qū)o密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的分布、定位以及結(jié)合能力的調(diào)節(jié)

由于TEER結(jié)果顯示EMAP-Ⅱ作用1 h時(shí)增加BTB通透性的效果最顯著，因此雙重免疫熒光和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)選擇模型組和EMAP-Ⅱ1 h組進(jìn)行研究。雙重免疫熒光結(jié)果顯示，在模型組緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1在BMEC的細(xì)胞邊緣呈連續(xù)分布，二者存在共定位；EMAP-Ⅱ作用后，能夠使occludin和ZO-1在BMEC的細(xì)胞邊緣的分布減少，呈現(xiàn)不連續(xù)分布，并且二者在細(xì)胞邊緣的共定位減弱（圖2）。免疫共沉淀結(jié)果證明，在BMEC中occludin和ZO-1能夠相互結(jié)合，EMAP-Ⅱ作用后二者的結(jié)合減弱（圖3）。

2.3 EMAP-Ⅱ?qū)KC活性的影響

模型組的BMEC中有一定的PKC活性，EMAP-Ⅱ作用能夠顯著增加PKC的活性，在EMAP-Ⅱ作用0.5 h時(shí)PKC活性開始升高，作用1 h時(shí)達(dá)峰值，而后逐漸降低，在12 h時(shí)基本恢復(fù)至EMAP-Ⅱ作用前水平（表 1）。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，EMAP-Ⅱ能夠降低體外BTB模型的TEER值，增加BTB通透性；改變體外BTB模型BMEC中緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1的分布，降低二者的結(jié)合能力；同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，EMAP-Ⅱ能夠增強(qiáng)BMEC中PKC的活性，并且PKC活性增強(qiáng)的變化時(shí)相與上述指標(biāo)的變化時(shí)相相同，提示EMAP-Ⅱ可能通過PKC途徑調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白的相互作用，增加BTB通透性。

腦膠質(zhì)瘤是臨床最常見的神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響人類健康。除手術(shù)治療外，化療是腦膠質(zhì)瘤術(shù)后治療的主要手段之一，但由于BTB的存在限制了抗腫瘤藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，嚴(yán)重影響了化療效果［7］。為了有效地將藥物轉(zhuǎn)運(yùn)到腦腫瘤組織，切實(shí)提高腦膠質(zhì)瘤的治療效果，過去的十幾年里科學(xué)家們一直在尋找能夠有效開放BTB的物質(zhì)，研究顯示如果腫瘤組織的藥物濃度提高2倍，其治療效應(yīng)則增加10倍。EMAP-Ⅱ是從腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)的，由其前體物質(zhì)proEMAP-Ⅱ分解而成，能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮和單核細(xì)胞的功能，目前對(duì)EMAP-Ⅱ作用的研究主要集中于其抗腫瘤作用［8］，EMAP-Ⅱ能夠選擇性開放BTB是我們研究小組近期的研究結(jié)果［3，5］，如果能充分利用 EMAP-Ⅱ的抗腫瘤特性和選擇性增加BTB通透性的作用，不僅可以使治療藥物靶向進(jìn)入腫瘤組織，而且能夠顯著提高藥物療效，減少藥物的不良反應(yīng)。但關(guān)于EMAP-Ⅱ開放BTB緊密連接的分子機(jī)制仍需深入探討。

跨膜蛋白o(hù)ccludin、claudin-5和胞質(zhì)附著蛋白ZO-1是構(gòu)成緊密連接的主要蛋白。ZO-1是第一個(gè)被確定的緊密連接相關(guān)蛋白，具有種屬依賴性，在內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接處尤為豐富，它是連接跨膜蛋白（如occludin和claudin-5）和細(xì)胞骨架蛋白actin的橋梁［9］。ZO-1屬于膜相關(guān)的鳥苷酸激酶樣蛋白家族，具有該家族成員所含有的3個(gè)保守的蛋白區(qū)域：PDZ區(qū)域、SH3區(qū)域和GUK區(qū)域。PDZ1區(qū)域直接與跨膜蛋白claudins的羧基末端相結(jié)合，而GUK區(qū)域則與跨膜蛋白o(hù)ccludin相互作用；另一方面ZO-1的羧基末端與細(xì)胞骨架蛋白actin相連［1］，這樣就通過ZO-1將跨膜蛋白定位于緊密連接，維持緊密連接的結(jié)構(gòu)與功能。如果上述蛋白的分布或相互作用發(fā)生改變，能夠直接影響緊密連接的完整性，進(jìn)而影響血腦屏障的通透性。本研究結(jié)果顯示，EMAP-Ⅱ能夠減少緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1在BMEC的細(xì)胞膜上的表達(dá)，并減弱二者在BMEC的結(jié)合，提示EMAP-Ⅱ可能通過影響occludin和ZO-1的相互作用，使錨定在內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接上的occludin減少，破壞緊密連接相關(guān)蛋白與細(xì)胞骨架蛋白的結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)緊密連接開放，增加BTB通透性。

PKC是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，幾個(gè)主要的緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5都具有多個(gè)PKC磷酸化位點(diǎn)，PKC激活后能通過磷酸化緊密連接相關(guān)蛋白并誘導(dǎo)其重分布，發(fā)揮直接調(diào)節(jié)緊密連接的作用［10］。研究顯示，PKC磷酸化腸上皮細(xì)胞 ZO-1后能夠降低 ZO-1與 occludin、ZO-1與claudin-1之間的相互作用，增加上皮細(xì)胞通透性［11］，但EMAP-Ⅱ是否通過PKC途徑調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白之間的相互作用尚不清楚。為此本研究應(yīng)用PKC活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)了EMAP-Ⅱ?qū)KC活性的影響，結(jié)果顯示EMAP-Ⅱ能夠顯著增強(qiáng)PKC的活性，并且PKC活性的變化時(shí)相與體外BTB模型通透性的變化時(shí)相以及緊密連接相關(guān)蛋白的分布和相互作用的變化時(shí)相一致，提示EMAP-Ⅱ可能通過PKC途徑調(diào)節(jié)緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1之間的相互作用，進(jìn)而開放緊密連接，增加BTB的通透性。

綜上所述，我們的研究結(jié)果提示EMAP-Ⅱ能夠通過減少緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin和ZO-1在BMEC細(xì)胞膜的表達(dá)，減弱二者的結(jié)合，增加BTB通透性，信號(hào)分子PKC可能參與了這一過程。本研究進(jìn)一步明確了EMAP-Ⅱ選擇性開放BTB緊密連接的分子機(jī)制，為EMAP-Ⅱ的臨床應(yīng)用提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Bernacki J，Dobrowolska A，Nierwińska K，et al.Physiology and pharmacological role of the blood-brain barrier［J］.Pharmacol Rep，2008，60（5）：600-622.

［2］Pardridge WM.Drug and gene delivery to the brain：the vascular route［J］.Neuron，2002，36（4）：555-558.

［3］ Xie H，Xue YX，Liu LB，et al.Endothelial-monocyte-activating polypeptideⅡincreases blood-tumor barrier permeability by down-regulating the expression levels of tight junction associated proteins［J］.Brain Res，2010，1319：13-20.

［4］Chang SY，Ko HJ，Heo TH，et al.Heparan sulfate regulates the antiangiogenic activity of endothelial monocyte-activating polypeptide-Ⅱ at acidic pH［J］.Mol Pharmacol，2005，67（5）：1534-1543.

［5］Li Z，Liu YH，Xue YX，et al.Role of ATP synthase alpha subunit in low-dose endothelial monocyte-activating polypeptide-Ⅱ-induced opening of the blood-tumor barrier［J］.J Neurol Sci，2011，300（1-2）：52-58.

［6］Harhaj NS，Antonetti DA.Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology ［J］.Int J Biochem Cell Biol，2004，36（7）：1206-1237.

［7］蔣軍，魏偉宏，馮彥林，等.99mTc-DTPA斷層顯像在全腦放療血腦屏障通透性研究中的應(yīng)用［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30（2）：329-330.

［8］Schwarz RE，Awasthi N，Konduri S，et al.Antitumor effects of EMAPⅡagainst pancreatic cancer through inhibition of fibronectindependent proliferation［J］.Cancer Biol Ther，2010，9（8）：632-639.

［9］Stevenson BR，Siliciano JD，Mooseker MS，et al.Identification of ZO-1：a high molecular weight polypeptide associated with the tight junction（zonula occludens）in a variety of epithelia［J］.J Cell Biol，1986，103（3）：755-766.

［10］Sj觟A，Magnusson KE，Peterson KH.Protein kinase C activation has distinct effects on the localization，phosphorylation and detergent solubility of the claudin protein family in tight and leaky epithelial cells［J］.J Membr Biol，2010，236（2）：181-189.

［11］Goldblum SE，Rai U，Tripathi A，et al.The active Zot domain（aa 288-293）increases ZO-1 and myosin 1C serine/threonine phosphorylation，alters interaction between ZO-1 and its binding partners，and induces tight junction disassembly through proteinase activated receptor 2 activation［J］.FASEB J，2011，25（1）：144-158.