杜鳳霞，劉峰群，張?jiān)婟?，周燕萍，?旭，凌?；?/p>

復(fù)方青花顆粒微生物限度檢查方法的驗(yàn)證

杜鳳霞，劉峰群，張?jiān)婟?，周燕萍，?旭，凌海慧

目的 建立復(fù)方青花顆粒的微生物限度檢查方法，并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。方法 采用2010年版《中華人民共和國藥典》(一部)附錄“微生物限度檢查法”項(xiàng)下相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，采用培養(yǎng)基法。結(jié)果 試驗(yàn)組5株試驗(yàn)菌回收率均＞70．00%，控制菌檢查陽性菌生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照組未檢出大腸桿菌，符合驗(yàn)證要求。結(jié)論 復(fù)方青花顆粒微生物限度可以采用常規(guī)法檢查。

復(fù)方青花顆粒;集落計(jì)數(shù)，微生物;閾限值

復(fù)方青花顆粒是我院抗流感特色中藥復(fù)方制劑，其處方主要由大青葉、金銀花、薄荷、甘草4味藥材組成，具有清熱解毒、宣肺利咽、散風(fēng)祛邪的功能，主要適用于流行性感冒屬風(fēng)熱毒邪者。其中，本品所含主要藥味大青葉、金銀花、薄荷和甘草對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等有一定的抑制作用［1-4］。為控制復(fù)方青花顆粒的質(zhì)量，我們對(duì)本品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了研究［5］，根據(jù)2010年版《中華人民共和國藥典》的相關(guān)規(guī)定［6］，為真實(shí)反映本品的污染情況，建立復(fù)方青花顆粒的微生物限度檢查方法并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SFG電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司);SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);XG1UK脈動(dòng)真空滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司);HZSH水浴振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.2 菌種 大腸埃希菌CMCC(B)44102，枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501，金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26003，黑曲霉 CMCC(F)98003，白色念珠菌CMCC(F)98001，均購于中國藥品生物制品檢定所。

1.3 培養(yǎng)基及稀釋劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL)、4-甲基傘形酮葡糖苷酸(MUG)培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)均購自中國藥品生物制品檢定所;pH 7．0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液，按2010年版《中華人民共和國藥典》(一部)附錄方法配制，0．9%無菌氯化鈉溶液(10 ml/支、250 ml/袋，自302醫(yī)院住院藥房請(qǐng)領(lǐng))。

1.4 供試品 復(fù)方青花顆粒(規(guī)格:5 g/袋，批號(hào):090705、090706、090707，解放軍 302 醫(yī)院藥學(xué)部制劑室)，經(jīng)外觀、粒度、干燥失重、溶化性、裝量差異等檢查項(xiàng)目檢查合格，并采用高效液相色譜法測(cè)定其綠原酸的含量在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

2 細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定方法的建立與驗(yàn)證

2.1 制備菌液 ①取經(jīng)32～35℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物各1 ml，用0．9%氯化鈉溶液10倍稀釋至10－5～10－7，使其成含菌數(shù)為 50 ～100 cfu/ml的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)后備用。②取經(jīng)25～28℃培養(yǎng)24 h的白色念珠菌的改良馬丁培養(yǎng)物1 ml，用0．9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋成含菌數(shù)為50～100 cfu/ml的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)后備用。③取經(jīng)25～28℃培養(yǎng)1周的黑曲霉的改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，用0．9%氯化鈉溶液5 ml洗下黑曲霉孢子，吸出孢子懸液1 ml，加0．9%無菌氯化鈉溶液適量，稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)比濁管濁度相當(dāng)?shù)逆咦討乙?，取此孢子懸? ml，用0．9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋至10－4～10－5，使其成為含菌數(shù)為 50 ～100 cfu/ml的菌懸液，做活菌計(jì)數(shù)后備用［6］。④以上各菌懸液或孢子懸液同時(shí)各取2份分別注入瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用平皿計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)活菌，結(jié)果見表1。

表1 各菌懸液或孢子懸液微生物檢查活菌計(jì)數(shù)

2.2 制備供試液 隨機(jī)抽取本樣品10袋，將內(nèi)容物研細(xì)，稱取樣品10 g，加入45℃ pH 7．0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液100 ml，振搖，使其均勻分散，即得1∶10供試液，取此供試液1 ml，加pH 7．0的無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液使其成10 ml，搖勻，即得1∶100供試液。

2.3 測(cè)定回收率 試驗(yàn)組:采用平皿法，各取供試液(1∶10)和實(shí)驗(yàn)菌液1 ml，分別平行注入2個(gè)平皿，立即加入相應(yīng)培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)48～72 h，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌落數(shù)。菌液組:測(cè)定每一種菌株所加的實(shí)驗(yàn)菌數(shù)。供試品對(duì)照組(常規(guī)法):取供試液(1∶10)1 ml注入平皿，立即加入規(guī)定的瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72 h，逐日觀察結(jié)果，作為供試品本底菌數(shù)。稀釋劑對(duì)照組:用相應(yīng)稀釋劑代替供試液加入實(shí)驗(yàn)菌，使菌液的最終濃度為50～100 cfu/ml，按試驗(yàn)組方法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。試驗(yàn)組的加菌回收率(%)=(試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)－供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組的平均菌落數(shù)×100%。本研究供試品接種至5株陽性代表試驗(yàn)菌株，利用常規(guī)法測(cè)定，結(jié)果表明5株陽性試驗(yàn)菌的回收率均在70．00%以上(表2)，提示本供試品無抑菌活性，故細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)均可采用常規(guī)法進(jìn)行測(cè)定。

表2 5株陽性試驗(yàn)菌活菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證回收試驗(yàn)結(jié)果

2.4 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.4.1 選擇菌種:復(fù)方青花顆粒屬于不含藥材原粉的中藥口服固體顆粒制劑，按照2010年版《中華人民共和國藥典》(一部)附錄規(guī)定微生物限度檢查法中有關(guān)控制菌檢查方法［6］，應(yīng)檢查大腸埃希菌。

2.4.2 制備菌液和供試液:菌液按2．1項(xiàng)下方法制備，菌數(shù)控制在10～100 cfu/ml。供試液按2．2項(xiàng)下方法制備。

2.4.3 驗(yàn)證方法和結(jié)果:取膽鹽乳糖培養(yǎng)基100 ml各6份，2份分別加入10 ml供試液(1∶10)及1 ml 10～100 cfu/ml大腸埃希菌懸液作為實(shí)驗(yàn)組，2份分別加入1 ml 10～100 cfu/ml大腸埃希菌懸液作為陽性對(duì)照組，余2份分別加入稀釋劑10 ml作為陰性對(duì)照組，均在33～35℃培養(yǎng)24 h。取上述各培養(yǎng)物0．2 ml，接種至含5 ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，分別于5、24 h時(shí)在波長(zhǎng)366 nm的紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照，依據(jù)參考文獻(xiàn)［6］微生物限度檢查方法進(jìn)行判定，結(jié)果顯示，控制菌檢查陽性菌生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照組未檢出菌(表3)。

表3 各組控制菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果

2.4.4 樣品控制菌檢查:3批供試品1∶10的供試液各10 ml，分別接種至100 ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中;另取含大腸桿菌數(shù)為10～100 cfu/ml菌懸液1 ml、pH 7．0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液10 ml分別接種至同樣培養(yǎng)基中作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。按2．4．3項(xiàng)下方法操作，結(jié)果表明，3批供試品均未檢出大腸桿菌，符合規(guī)定，而陽性對(duì)照組檢出大腸桿菌。

3 討論

通過以上驗(yàn)證，我們認(rèn)為復(fù)方青花顆粒微生物限度檢查方法可參考以下程序:取供試品10 g，加入45℃、pH 7．0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液100 ml，振搖，使其分散均勻，得1∶10供試液;取1∶10供試液1 ml，加pH 7．0無菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液使其成10 ml，搖勻，得1∶100供試液。采用常規(guī)法測(cè)定細(xì)菌、真菌及酵母菌總數(shù);另取本品采用常規(guī)法檢查控制菌。細(xì)菌、真菌及酵母菌數(shù)≤100 cfu/ml;金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌應(yīng)不得檢出。

根據(jù)2010年版《中華人民共和國藥典》收載的方法對(duì)常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證，結(jié)果表明按常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定的5種試驗(yàn)菌回收率均＞70．00%，提示本品對(duì)細(xì)菌、霉菌和酵母菌無抑制作用，均符合2010年版《中華人民共和國藥典》中方法學(xué)驗(yàn)證規(guī)定，因此，采用常規(guī)法檢查復(fù)方青花顆粒微生物限度可行。

綜上所述，在復(fù)方青花顆粒微生物限度檢查中細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)制備菌液尤其重要。菌液中含有菌落數(shù)的多少直接影響其檢查誤差。因此需要通過反復(fù)多次試驗(yàn)，摸索出接種環(huán)刮取菌苔的量及稀釋菌液的經(jīng)驗(yàn)方法，在菌液制備后，同時(shí)進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)和供試品的方法驗(yàn)證，這樣才能將菌落數(shù)控制在50～100 cfu/ml。此外，在進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)時(shí)，3次試驗(yàn)的菌原液濃度應(yīng)盡量保持一致，除黑曲霉孢子懸液外，其他試驗(yàn)菌菌懸液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，這樣才能保證驗(yàn)證結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

［1］趙良忠，蔣賢育，段林東，等．金銀花水溶性抗菌物質(zhì)的提取及其抑菌效果研究［J］．中國生物制品學(xué)雜志，2006，19(2):201-203．

［2］張連同，邱世翠，呂俊華，等．大青葉體外抑菌作用研究［J］．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2002，13(5):283-284．

［3］劉銳，莫倩美．薄荷水提取物抑菌活性的研究［J］．農(nóng)業(yè)機(jī)械，2011(10):166-169．

［4］丁長(zhǎng)玲，邱世翠，宮照龍，等．甘草的體外抑菌作用研究［J］．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2002，13(9):518．

［5］杜鳳霞，劉峰群，周旭，等．復(fù)方青花顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］．解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26(4):304-306．

［6］國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典(一部)［M］．北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:79-88．

Verification of Microbial Limit in Testing Compound Recipe Qinghua Granule

DU Feng-xia，LIU Feng-qun，ZAHNG Shi-long，ZHOU Yan-ping，ZHOU Xu，LING Hai-hui(Department of Pharmacy，the 302ndHospital of PLA，Beijing 100039，China)

Objective To establish a testing method of microbial limit for compound recipe Qinghua granule and validate it．Methods The testing method was jerqued by culture media under the guidance of the microbial limit test，which is described in the appendix of China Pharmacopoeia(2010 edition，VolumeⅠ)．Results The coefficient of recovery of the test organism in 5 stubs was higher than 70．00%，positive bacteria growed well in control bacteria，and no escherichiacoli was found in the negative control group．Conclusion Routine testing method is useful in microbial limit test for compound recipe Qinghua granule．

Compound recipe Qinghua granule;Colony count，microbial;Threshold limit values

R927．33

A

2095-140X(2012)08-0050-03

10．3969/j．issn．2095-140X．2012．08．015

2012-04-27 修回時(shí)間:2012-05-09)

100039北京，解放軍302醫(yī)院藥學(xué)部

劉峰群，電話:13691157302