方 瑜 李仁廷 陳光偉 陜西中醫(yī)學(xué)院（咸陽(yáng) 712046）

原發(fā)性肝癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人民群眾的生命及健康。我國(guó)是原發(fā)性肝癌的高發(fā)地區(qū)，據(jù)最新估計(jì)，2008年全球新增肝癌患者約74.8萬(wàn)，其中我國(guó)40.2萬(wàn)（54%）［1，2］。其起病隱匿、病程較短、來(lái)勢(shì)兇險(xiǎn)、侵襲性強(qiáng)、死亡率較高（20.4／10萬(wàn)），已成為一個(gè)極其嚴(yán)重的國(guó)際衛(wèi)生問(wèn)題［3］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立H22腹水型瘤株移植瘤小鼠模型，研究山仙顆粒對(duì)肝癌小鼠的癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響和可能的作用機(jī)制，通過(guò)對(duì)TGF－α和端粒酶的表達(dá)來(lái)分析，從而為山仙顆粒在臨床上的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料 1.1 肝癌移植型瘤株 H22腹水型肝癌瘤株，（由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），昆明小鼠腹腔內(nèi)傳代7d。合格證號(hào)：SCXK（軍2011－005）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康雌性KM小鼠85只，體重18～22g，月齡1～1.5月。（由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（陜2007－001）。

1.3 實(shí)驗(yàn)用藥 山仙顆粒（SXG）：（陜中附院制劑研究中心，批號(hào)：20110527，組方：西洋參30g，延胡索24g，莪術(shù)、仙鶴草、山楂各15g，龜版、鱉甲、豬苓各12g，），SXG按小鼠5g／kg（相當(dāng)于臨床用量）用生理鹽水配置成0.5g／mL混懸液。陽(yáng)性對(duì)照藥替加氟（50mg／片，生產(chǎn)批號(hào)：20110305）研磨，按成人用量1000mg／d（成人體重60kg）計(jì)算，加入蒸餾水0.3mL，則濃度為1000mg÷60kg×9.01×0.02kg÷0.2mL＝15mg／mL。

1.4 試劑 兔抗小鼠TGF－α單克隆抗體（一抗），產(chǎn)品編號(hào)：bs－0066R，0.1mL；TRT／TERT 端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶抗體，產(chǎn)品編號(hào)：bs－0233R，0.2mL；羊抗兔多克隆抗體（二抗），DAB顯色劑，型號(hào)：C－0003；均購(gòu)于北京博奧森生物科技有限公司；SP免疫組化試劑盒，型號(hào)：SP－9002；購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。4%多聚甲醛、0.1mmol／L PBS緩沖液由陜西中醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)配置。

2 方 法 2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法 在無(wú)菌的工作臺(tái)上，抽取接種7d的H22瘤株的小鼠腹水，離心后選用底層較濃稠的腹水液，借助于0.02%伊紅稀釋染色，計(jì)算活腫瘤細(xì)胞數(shù)（未被染為紅色的為活腫瘤細(xì)胞），用生理鹽水稀釋成1×107／mL的瘤細(xì)胞懸液，將85只健康小鼠隨機(jī)抽取15只作為空白組，A組：空白組；其余70只共同造模，將造模成功的小鼠納入60只，隨機(jī)分為4組，每組15只。B組：荷瘤對(duì)照組；C組：替加氟組；D組：山仙顆粒組；E組：山仙顆粒＋替加氟組。將瘤細(xì)胞懸液按0.25mL／只在小鼠右腋皮下接種造模，共70只，以小鼠右腋下出現(xiàn)組織腫塊為接種成功，63只小鼠出現(xiàn)組織腫塊，接種成功率為90%。去除3只，將剩余小鼠隨機(jī)分為4組，每組15只進(jìn)行給藥。A組：（0.9% 生理鹽水，0.2mL／只）灌胃；B組（0.9% 生理鹽水，0.2mL／只）灌胃；C組（15mg／mL替加氟稀釋液，0.2mL／只）灌胃；D 組（0.5g／mLSXG，0.2mL／只）灌胃；E組（濃度為1g／mLSXG，0.1mL，濃度為30mg／mL替加氟溶液0.1mL／只）灌胃；各組小鼠每日灌胃1次，連用藥14d，E組第1天及第7天采用兩藥共同灌胃，其他時(shí)間采用D組用藥方法，用藥14d。小鼠于用藥后第15天脫臼處死。

2.2 計(jì)算抑瘤率和胸腺、脾臟指數(shù) 在干凈工作臺(tái)上，剝離瘤體及其周圍組織，用濾紙吸干水分后，稱瘤重，自來(lái)水沖洗，并將其固定于10%的甲醛中，隨后摘除小鼠胸腺、脾臟，稱重后計(jì)算抑瘤率及臟器指數(shù)。其公式分別如下：抑瘤率＝（荷瘤組平均瘤重－實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）／荷瘤組平均瘤重×100%；臟器指數(shù)＝臟器的重量mg／小鼠的體重g。

2.3 免疫組化法測(cè)定TGF－α和端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶活性的表達(dá) 將腫瘤組織常規(guī)病理取材，石蠟包埋，5um連續(xù)切片，二甲苯脫蠟；染色程序按免疫組化SP法常規(guī)進(jìn)行。TGF－α陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物為棕色顆粒樣，主要定位于細(xì)胞漿或（和）細(xì)胞核。端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶TERT所表現(xiàn)出的顏色是棕褐色或者棕黃色散在分布的顆粒，其位置在細(xì)胞漿里。將免疫組化結(jié)果經(jīng)圖像分析軟件處理，用400倍光學(xué)顯微鏡觀察，每例隨機(jī)觀察5個(gè)視野，不少于100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。陽(yáng)性表達(dá)率＝表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／總細(xì)胞數(shù)×100%。

3 結(jié) 果 3.1 各組藥物對(duì)小鼠H22肝癌實(shí)體瘤的抑制作用 見(jiàn)表1。

表1 各組藥物對(duì)H22荷瘤小鼠的抑瘤作用

3.2 各組藥物對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響 見(jiàn)表2。

表2 各組藥物對(duì)H22荷瘤小鼠免疫功能的影響

3.3 各組小鼠癌組織中TGF－α和端粒酶的表達(dá)情況見(jiàn)表3。

表3 各組藥物對(duì)H22荷瘤小鼠移植瘤TGF－α和端粒酶表達(dá)的結(jié)果

荷瘤組肝癌組織TGF－α（×400）替加氟組肝癌組織TGF－α（×400）SXG組肝癌組織TGF－α（×400）聯(lián)合用藥組肝癌組織TGF－α（×400）

荷瘤對(duì)照組 端粒酶（×400） 替加氟組 端粒酶（×400） SXG組 端粒酶 （×400）聯(lián)合用藥組 端粒酶 （×400）

4 討 論 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α與表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）結(jié)合級(jí)聯(lián)激活 MAPK 信號(hào)系統(tǒng)（Raf－MEK－ERK）［4］，促使DNA合成從而使細(xì)胞增殖、分化，使腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)不受機(jī)體控制，致細(xì)胞增殖失控，從而形成癌變。研究發(fā)現(xiàn)［5］，TGF－α表達(dá)明顯與肝癌細(xì)胞的凋亡呈負(fù)相關(guān)，TGF－α表達(dá)減弱可以加速肝癌癌細(xì)胞的凋亡，而TGF－α表達(dá)增強(qiáng)則會(huì)抑制肝癌癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。隨著肝癌病變進(jìn)展，TGF－α陽(yáng)性肝細(xì)胞數(shù)逐漸增多，TGF－α反 應(yīng)明顯增強(qiáng)，血清 TGF－α水平增加［6、7］。本 實(shí) 驗(yàn)顯示，在小鼠肝癌組織中，用藥組TGF－α蛋白的表達(dá)均降低（P＜0.05），其中聯(lián)合用藥組最為明顯（P＜0.01）。端粒酶是一種核糖核蛋白酶，在胚性細(xì)胞等復(fù)制活躍的細(xì)胞中具有活性，在正常發(fā)育完整的體細(xì)胞中端粒酶卻失去了原本的活性，并且在絕大部分癌細(xì)胞中都表現(xiàn)出端粒酶為（＋），但是在癌旁組織、正常組織，陽(yáng)性的概率卻不高，可以認(rèn)為端粒酶應(yīng)該是腫瘤的特異性標(biāo)志物。端粒酶的活性根據(jù)原發(fā)性肝癌發(fā)生和發(fā)展，表現(xiàn)出逐漸增多的反應(yīng)。激發(fā)端粒酶也許是導(dǎo)致原發(fā)性肝腫瘤進(jìn)一步發(fā)生、發(fā)展的繼發(fā)性變化［8］，本實(shí)驗(yàn)顯示，荷瘤組小鼠端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶活性過(guò)度表達(dá)，顯著高于各用藥組 （P＜0.01），說(shuō)明用藥物可以抑制肝癌細(xì)胞端粒酶的表達(dá)，其中以聯(lián)合用藥組最為明顯（P＜0.01）。SXG組和替加氟組都有抗腫瘤生的作用（P＜0.01），但對(duì)小鼠免疫功能的影響之間有著顯著的差異（P＜0.01）。說(shuō)明山仙顆粒在抑制腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)，也能夠改善小鼠的一般狀況，提高小鼠的生活質(zhì)量和保護(hù)免疫器官功能；西藥替加氟在殺傷機(jī)體腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常的組織細(xì)胞和機(jī)體的免疫功能也有明顯的損傷。聯(lián)合用藥組在抑瘤率和減少TGF－α和端粒酶表達(dá)方面優(yōu)于單純用藥組，說(shuō)明聯(lián)合用藥具有減毒增效的作用。肝癌的發(fā)病是因虛致病，因病致虛，氣虛毒瘀為其基本病理狀態(tài)，山仙顆粒是陜西省名中醫(yī)陳光偉的經(jīng)驗(yàn)方，以“扶正祛邪”為總則，由西洋參、莪術(shù)、龜版、鱉甲、延胡索、仙鶴草、豬苓、山楂等藥組成，通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)說(shuō)明該中藥抗肝癌的機(jī)理可能與降低TGF－α和端粒酶的表達(dá)及提高小鼠免疫功能有關(guān)。

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