胡曉松，唐 瑜，李 娟，劉馨蓮，孫 靜

臨床上許多疾病均可導(dǎo)致腦缺血的發(fā)生，隨著對(duì)腦缺血疾病研究的逐漸深入，腦缺血耐受 (brain ischemic tolerance，BIT)現(xiàn)象越來越受到人們的關(guān)注。目前認(rèn)為給予1次或多次短暫、輕微 (亞致死量)的缺血缺氧刺激即腦缺血預(yù)處理(CIP)，可作為一種損傷性應(yīng)激原刺激而有效調(diào)動(dòng)機(jī)體自身的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，從而誘導(dǎo)BIT的發(fā)生，增加機(jī)體對(duì)下一次嚴(yán)重?fù)p傷的抵抗能力，但其作用機(jī)制目前仍不明了［1－2］。

Toll樣受體 (Toll－like receptors，TLRs)是一個(gè)介導(dǎo)天然固有免疫的古老家族，在感染性炎癥中扮演著重要角色。近來研究發(fā)現(xiàn)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路，在非病原性炎癥中亦占有重要地位。本實(shí)驗(yàn)通過研究TLR4及其靶基因蛋白核蛋白印跡法因子－κB(NF－κB)在CIP后腦缺血梗死區(qū)周圍的表達(dá)變化，旨在探討該信號(hào)通路在BIT誘導(dǎo)機(jī)制中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康7～8周的SD雄性大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量250～300 g，共45只。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組，CIP組:給予CIP 20 min，3 d后給予大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)2 h，再灌注6 h、24 h、72 h;MCAO組:未行CIP，單純暴露動(dòng)脈處的解剖結(jié)構(gòu)20 min(假手術(shù))，余同CIP組;Sham組:兩次均為假手術(shù)，均暴露解剖結(jié)構(gòu)，未進(jìn)行缺血處理。每組各時(shí)間點(diǎn)5只。

1.2 動(dòng)物模型的制備 參照并改良局灶－局灶性腦缺血預(yù)處理模型［3］制備方法，大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水，以4%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉 (7.5 ml/kg)，置仰臥位，于頸部行長約25.0 mm常規(guī)縱行切口。暴露并鈍性游離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈 (ICA)及頸外動(dòng)脈 (ECA)，結(jié)扎ECA遠(yuǎn)側(cè)端，動(dòng)脈夾夾閉CCA近心端，在結(jié)扎線近端距分叉5.0 mm處剪一約0.2 mm小口。取浸于2.5×106U/L肝素鈉的長6.0 cm、直徑0.26 mm、頭端圓鈍的尼龍線從ECA殘端插入，經(jīng)CCA分叉部進(jìn)入ICA(19.0±0.5)mm，直至感覺有阻力時(shí)，結(jié)扎ECA近心端。20 min后輕輕抽出栓線約10 mm形成第1次再灌注，固定尼龍線并全層縫合切口。3 d后再次麻醉大鼠，找到ECA結(jié)扎處，重新剪口插線阻斷大腦中動(dòng)脈(MCA)，結(jié)扎ECA，并留置長約4.0 cm的尼龍線于體外，縫合皮膚。2 h后抽出栓線，形成第2次再灌注。

1.3 神經(jīng)病學(xué)評(píng)分及MCAO模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn) 參照Longa等［4］神經(jīng)病學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0分:無神經(jīng)功能缺損癥狀;1分:輕度局灶性神經(jīng)功能缺損 (不能完全伸展右前肢);2分:中度神經(jīng)功能缺損 (向右側(cè)轉(zhuǎn)圈);3分:重度神經(jīng)功能缺損(向右側(cè)傾倒);4分:不能自發(fā)行走，意識(shí)水平降低。MCAO模型成功標(biāo)準(zhǔn):動(dòng)物出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，無煩躁不安、抬頭狂體征，評(píng)分為1～3分。

1.4 取材制片 大鼠腦缺血2 h，于再灌注預(yù)定時(shí)間點(diǎn)麻醉后，用0.9%氯化鈉溶液快速?zèng)_洗血管，迅速斷頭取腦，立即置于－20℃冰箱冷凍10 min，用腦切片器按2.0 mm厚度切片，選取距前囟點(diǎn) (Bregma)0.6～1.4 mm的腦片行免疫組織化學(xué)染色。4%多聚甲醛固定12～24 h后行脫水、透明、石蠟包埋。切片厚度5 μm。其余腦片行0.1%四氮唑紅 (TTC)染色。

1.5 腦梗死體積比測(cè)定 將腦片浸入37℃的TTC染色后［5］，置于4%多聚甲醛中固定6 h。正常組織染成深紅色，梗死灶呈蒼白色。將固定的腦片按順序排列。拍照腦片前后兩面后輸入計(jì)算機(jī)，根據(jù)所測(cè)各腦片厚度以及梗死面積 (用于免疫組織化學(xué)的腦片的梗死面積和腦片面積分別以緊鄰其前后腦片的平均值近似計(jì)入)和腦片面積計(jì)算出梗死體積和前腦體積的近似值，得出TTC染色為蒼白區(qū) (梗死區(qū))占前腦體積的百分比。

1.6 免疫組織化學(xué)染色 免疫組織化學(xué)染色采用即用型二步法，TLR4(1∶200，Abcam 公司) 及 NF － κB/P65(1∶500，Abcam公司)，二步法試劑PV－6002由北京中杉金橋生物公司 (美國Zymed公司分裝產(chǎn)品)提供。陰性對(duì)照用正常血清代替一抗。

1.7 蛋白印跡法 (Western blot)檢測(cè) Western blot測(cè)定TLR4及NF－κB表達(dá)，取保存于液氮中的缺血半影區(qū)腦組織100 mg，剪碎，Radio免疫沉淀反應(yīng)分析 (RIPA)裂解液裂解后冰浴下玻璃勻漿器中勻漿，離心半徑6.8 cm，12 000 r/min 4℃離心15min，取上清。Bradford法蛋白定量，每孔加樣量30 μg，7.5%SDS－PAGE電泳;蛋白轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%牛血清清蛋白 (BSA)的吐溫三羥甲基氨基甲烷緩沖液 (TBS/T)室溫封閉1 h，加兔抗大鼠TLR4(1∶100)、兔抗大鼠 NF－κB(1∶200)和兔抗大鼠 β－actin抗體(1∶1 000)，4℃反應(yīng)過夜;取膜，TBS/T洗5 min×3次，加辣根過氧化物酶 (HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗孵育;電化學(xué)發(fā)光劑 (ECL)顯影，圖像使用Total Lab軟件灰度掃描，計(jì)算目的蛋白 (TLR4及NF－κB)與內(nèi)參蛋白β－actin吸光度的比值。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.8 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 陽性表達(dá)為結(jié)構(gòu)完整、定位明確的著色較深 (棕褐色)的細(xì)胞。切片在統(tǒng)一放大倍數(shù) (40×10)下，隨機(jī)選6個(gè)視野，輸入Image pro－plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，記取平均陽性細(xì)胞數(shù)。計(jì)量資料以 (±s)表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn);以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦梗死體積比 Sham組未見梗死灶。MCAO組腦梗死灶位于基底節(jié)區(qū)靠近紋狀體外側(cè)區(qū)域及額頂部外側(cè)皮質(zhì)。CIP組和MCAO組TTC染色均可見正常腦組織被染成紅色，而梗死區(qū)域呈蒼白色。梗死區(qū)與周圍正常腦組織界限清晰。結(jié)果顯示再灌注24 h、72 h時(shí)，CIP組腦梗死體積比與MCAO組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。

表1 CIP組與MCAO組腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)腦梗死體積比比較(x ± s，%)Table 1 Comparison of brain infarct volume at different time after reperfusion between CIP group and MACAO group

2.2 免疫組化染色 TLR4、NF－κB陽性細(xì)胞主要表達(dá)于缺血側(cè)胼胝體、紋狀體、大腦皮質(zhì)等處的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元。Sham組僅見微血管壁及脈絡(luò)叢上皮、室管膜上皮等處的弱表達(dá)，TLR4陽性表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞質(zhì)。再灌注6 h起，MCAO組即見TLR4明顯表達(dá)，并達(dá)高峰。TLR4膠質(zhì)細(xì)胞樣陽性細(xì)胞可見核腫脹及較短突起 (見圖1);NF－κB陽性表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，表達(dá)高峰于再灌注24 h出現(xiàn)。3組不同再灌注時(shí)間點(diǎn)的TLR4及NF－κB陽性細(xì)胞數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);其中MCAO組及CIP組各再灌注時(shí)間點(diǎn)TLR4及NF－κB陽性細(xì)胞數(shù)與Sham組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01);CIP組各再灌注時(shí)間點(diǎn)TLR4及NF－κB陽性細(xì)胞數(shù)與MCAO組比較，差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01，見表2)。

2.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果 TLR4蛋白表達(dá)高峰出現(xiàn)于再灌注后6 h，而NF－κB則出現(xiàn)于再灌注后24 h(見圖2)。CIP組各再灌注時(shí)間點(diǎn)TLR4及NF－κB蛋白表達(dá)的相對(duì)吸光度值與MCAO組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01，見表3)。

圖2 不同再灌注時(shí)間點(diǎn)TLR4及NF－κB蛋白表達(dá) (Western blot檢測(cè))Figure 2 Expressions of TLR4 and NF－κB protein detected by Western blot at different time after reperfusion

圖1 缺血再灌注24 h時(shí)腦梗死區(qū)周圍的TLR4及NF－κB表達(dá)情況 (×400)Figure 1 Expressions of TLR4 and NF－κB around infarct area at 24 h after cerebral ischemia－reperfusion

表2 3組大鼠不同再灌注時(shí)間點(diǎn)TLR4及NF－κB陽性細(xì)胞數(shù)比較 (±s)Table 2 Comparison of numbers of TLR4 and NF－κB positive cells at different time after reperfusion in three groups

表2 3組大鼠不同再灌注時(shí)間點(diǎn)TLR4及NF－κB陽性細(xì)胞數(shù)比較 (±s)Table 2 Comparison of numbers of TLR4 and NF－κB positive cells at different time after reperfusion in three groups

注:與Sham組比較，*P＜0.01;與MCAO組比較，▲P＜0.01

組別 例數(shù) TLR4陽性細(xì)胞數(shù)NF－κB陽性細(xì)胞數(shù)6 h 24 h 72 h Sham組 5 6.30±1.15 9.38±1.57 4.29±0.41 5.67±1.32 7.20±1.35 6.38±1.10 6 h 24 h 72 h CIP組 5 56.96±4.32＊▲ 43.44±3.84＊▲ 32.77±4.76＊▲ 31.98±3.26＊▲ 41.57±5.91＊▲ 24.36±3.42＊▲MCAO組 5 72.34±6.68* 60.57±5.96* 42.32±4.87* 43.44±5.24* 55.90±6.84* 37.61±2.57*F 277.37 193.08 126.23 141.44 112.54 189.06 P值值＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表3 CIP組與MCAO組不同再灌注時(shí)間點(diǎn)TLR4及NF－κB蛋白表達(dá)的相對(duì)吸光度值比較 (±s)Table 3 Comparison of relative absorbance values of TLR4 and NF－κB protein at different time after reperfusion between CIP group and MACAO group

表3 CIP組與MCAO組不同再灌注時(shí)間點(diǎn)TLR4及NF－κB蛋白表達(dá)的相對(duì)吸光度值比較 (±s)Table 3 Comparison of relative absorbance values of TLR4 and NF－κB protein at different time after reperfusion between CIP group and MACAO group

組別 例數(shù) TLR4蛋白表達(dá)NF－κB蛋白表達(dá)42±0.05 0.28±0.03 MCAO組 5 0.62±0.06 0.48±0.04 0.38±0.04 0.44±0.03 0.58±0.05 0.39±0.04 t 6 h 24 h 72 h CIP組 5 0.44±0.03 0.35±0.05 0.24±0.02 0.31±0.03 0.6 h 24 h 72 h 6.28 4.71 7.25 8.51 5.61 5.29 P值值＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

BIT是機(jī)體對(duì)內(nèi)外環(huán)境損傷刺激固有的應(yīng)激和防御反應(yīng)，也是迄今已知的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制中作用最強(qiáng)大的，但其發(fā)生機(jī)制仍未闡明。近來，隨著TLRs在炎癥研究領(lǐng)域的不斷深入，TLRs信號(hào)通路在BIT中的作用也逐漸得到重視。目前已分別在人類及小鼠中發(fā)現(xiàn)11種、13種TLRs［6］，TLR4作為“門戶”蛋白啟動(dòng)機(jī)體的炎癥鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在Ⅰ型跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體家族TLRs中扮演著重要角色。TLR4通過與接頭蛋白MyD88及白介素 (IL)相關(guān)激酶 (IRAKs)的結(jié)合，可促使NF－κB移位，啟動(dòng)與天然免疫及炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而激活TLR4－MyD88依賴性的信號(hào)傳導(dǎo)通路［7］。

NF－κB是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，屬于Rel蛋白家族，是多種損傷反應(yīng)基因的多效調(diào)節(jié)因子。在靜息細(xì)胞中，它常與其抑制性蛋白I－κB結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。各種刺激引起I－κB磷酸化并被降解，導(dǎo)致I－κB與NF－κB解聚，引起NF－κB被激活并發(fā)生核轉(zhuǎn)位?；罨腘F－κB通常以環(huán)狀的p65/p50異二聚體的形式進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合至DNA上的相應(yīng)位點(diǎn)，調(diào)控下游含有NF－κB結(jié)合序列的靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［8－9］，引起 IL－1、IL －6、IL －12、IL －8、腫瘤壞死因子α(TNF－α)及干擾素γ(IFN－γ)等細(xì)胞因子的釋放，并調(diào)節(jié)谷氨酸鹽受體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、血－腦脊液屏障破壞等腦缺血損傷過程［10－14］。

本研究表明CIP能夠明顯減輕缺血再灌注24 h及72 h的腦梗死體積，20 min CIP可誘導(dǎo)BIT的發(fā)生，從而發(fā)揮對(duì)第2次腦缺血再灌注損傷的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)作用。然而，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)CIP并未導(dǎo)致再灌注6 h時(shí)的腦梗死體積比降低，我們推測(cè)這種遲滯現(xiàn)象可能與缺血半影區(qū)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能恢復(fù)、某些生成抗炎因子 (如IL－10等)的基因激活、局部血液循環(huán)的改善等均需一定的時(shí)程有關(guān)。

一般認(rèn)為，非致死性的CIP刺激首先引起輕度的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的損傷，釋放少量內(nèi)源性配體，輕度激活TLR4信號(hào)通路，導(dǎo)致少量炎性遞質(zhì)釋放，誘發(fā)輕微炎癥反應(yīng)，同時(shí)上調(diào)抗炎因子、誘餌受體等的表達(dá)，抑制第2次嚴(yán)重腦缺血所誘發(fā)的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)［15］。在藥物誘導(dǎo)BIT的研究中，有報(bào)道提示Oxymatrine等可通過下調(diào)TLR4、上調(diào)ERK信號(hào)通路發(fā)揮腦保護(hù)作用［16－17］。本實(shí)驗(yàn)免疫組織化學(xué)染色及Western bolt檢測(cè)結(jié)果顯示CIP組各時(shí)間點(diǎn)TLR4與NF－κB陽性細(xì)胞數(shù)及相對(duì)吸光度值均明顯低于MCAO組同時(shí)間點(diǎn)相應(yīng)各值，證實(shí)CIP可明顯抑制TLRs炎癥信號(hào)通路中的兩種重要蛋白TLR4與NF－κB的激活，結(jié)果表明該信號(hào)通路在BIT的發(fā)生過程中扮演著重要作用。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)隨著腦缺血再灌注時(shí)間延長，TLR4蛋白與NF－κB的表達(dá)到達(dá)高峰的時(shí)間并不一致，TLR4在再灌注早期 (6 h)即達(dá)高峰，而NF－κB在再灌注后24 h才到達(dá)峰值，這可能主要與TLR4作為NF－κB的上游受體需先行激活有關(guān)。此外，是否存在其他炎性受體如TLR2、TLR9激活導(dǎo)致炎性因子NF－κB等大量表達(dá)的可能性，尚需進(jìn)一步的研究。

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