潘 博 付文卓 王曉娜 張寶中 米志強 安小平 劉大斌李 存 姜煥煥 陳 斌 童貽剛*

(1.軍事醫(yī)學科學院微生物流行病所國家重點實驗室，北京100071;2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院國家海綿狀腦病實驗室，北京100193;3.首都醫(yī)科大學醫(yī)學實驗與測試中心，北京100069)

噬菌體抗體庫技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為抗體技術(shù)領(lǐng)域帶來了巨大的變化，已被廣泛應(yīng)用于生物學、醫(yī)學等各個研究領(lǐng)域，通過基因工程和噬菌體展示技術(shù)的結(jié)合，能得到人源化的針對幾乎所有抗原表位的抗體，這極大地推動了各種性能優(yōu)良抗體及多功能抗體融合蛋白的開發(fā)和應(yīng)用［1-3］。噬菌體抗體庫模擬了天然抗體庫，使得人們可以不經(jīng)過復(fù)雜的免疫過程，而是直接利用抗原就可以從抗體庫中篩選出特異性抗體成為可能。它既解決了人源性單克隆抗體的來源困難、人體雜交瘤系統(tǒng)的低效及鼠單抗的動物源性等難題，也使得單克隆抗體的制備變得簡單易行，穩(wěn)定有效，使人單克隆抗體的制備有了突破。但是，此技術(shù)目前還有許多問題尚待解決，如在保證抗體庫的多樣性和呈現(xiàn)效率的同時，如何提高有效庫容量、如何在構(gòu)建抗體庫時提高抗體基因的連接效率問題上，還有待進一步解決。為了克服這些問題，本研究擬在本室多年抗體工程研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建含自殺基因的新型、高效抗體庫表達載體pDF-D-SacB。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒

噬菌體VCSM13、BSl365菌、表達載體pDF由海軍總醫(yī)院周麗君教授饋贈;Puc19-SacB質(zhì)粒由軍事醫(yī)學科學院疾病預(yù)防控制所黃留玉研究員饋贈;帶有抗乙肝病毒表面抗原人Fab段基因的質(zhì)粒B4HFLF由本室保存。

1.2 主要試劑

Phusion，BssH Ⅱ，Xba Ⅰ，Nco Ⅰ，NheⅠ，BglⅡ，堿性磷酸酶，由美國New England Biolabs(NEB)公司生產(chǎn);EcoR Ⅰ，DraⅠ，T4 DNA Ligase，T4 Plolynucleotide Kinnase(PNK)由日本TaKaRa中國大連分公司生產(chǎn);EasyPure Plasmid MiniPrep Kit，EasyPure Quick Gel Extraction Kit由中國北京全式金生物有限公司提供;5000 DNA Marker，DL2 000 DNA Marker由中國北京博邁德科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 引物設(shè)計及合成

為了提高輕鏈抗體基因連接效率，設(shè)計了2條引物來改造原始噬菌粒載體pDF上用以連接輕鏈抗體基因的酶切位點BssHⅡ，其新的酶切位點為BglⅡ，同時設(shè)計用于克隆SacB自殺基因的引物序列來構(gòu)建抗體庫載體，具體引物序列詳見表1，以及用于克隆抗乙肝表面抗原抗體的引物序列，具體引物詳見表2，所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列Tab.1 Primers

表2 引物序列Tab.2 Primers

1.4 表達載體pDF-D-SacB的構(gòu)建

1.4.1 驗證SacB的自殺功能

從平板上挑取攜帶有pUC19-SacB質(zhì)粒的單克隆至3 mL含有氨卞抗性液體LB培養(yǎng)基中，在37℃搖床中220 r/min振搖10 h至對數(shù)生長期;取上述菌液200 μL分別加入到預(yù)先準備好5 mL含有氨卞抗性液體LB培養(yǎng)基和含有氨卞抗性及5%蔗糖液體LB培養(yǎng)基2支試管中，在37℃搖床上220 r/min振搖5 h，將2支試管的菌液分別從10-1稀釋至10-9，各取每個稀釋梯度的菌液5 μL，加入到預(yù)先準備的含有氨卞抗性固體LB培養(yǎng)基平板上相應(yīng)的格子中，放入37℃溫箱中，次日觀察結(jié)果。

1.4.2 構(gòu)建質(zhì)粒pDF-D-SacB

以Puc19-SacB為模板，pDF-BssH和pDF-R-Xba為引物，進行PCR擴增獲得輕鏈區(qū)域SacB基因并純化回收，用BssHⅡ和XbaⅠ進行酶切，與同樣經(jīng)電泳分離、純化、酶切的PSGX載體用T4 DNA連接酶16℃連接，連接物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，鋪盤挑取單集落，提取質(zhì)粒DNA，以HindⅢ內(nèi)切酶鑒定陽性克隆PSBX;再用BssHⅡ50℃酶切質(zhì)粒PSBX 3.5 h后，加入1 μL CIP，溫度降至37℃酶切1 h后進行回收。將引物DDTB-F和DDTB-R 各取 2 μL，加 H2O 到總體積為 20 μL，放入PCR儀中由98℃ ～20℃進行退火，取出17 μL與10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL 混合，再加入1 μL T4 Plolynucleotide Kinnase，37℃反應(yīng)30 min，而后70℃反應(yīng)10 min，將兩者進行常規(guī)連接、轉(zhuǎn)化、挑克隆后，用BglⅡ與EcoRⅤ鑒定，獲得陽性克隆PSGX;再以Puc19-SacB為模板，引物pDF-Nco和pDF-R-Nhe進行PCR擴增獲得重鏈區(qū)域SacB基因并純化回收，用NheⅠ和NcoⅠ進行酶切，與同樣經(jīng)電泳分離、純化、酶切的PSGX載體用T4 DNA連接酶16℃連接，常規(guī)轉(zhuǎn)化、鋪盤、挑取單集落，提取質(zhì)粒后用EcoRⅠ對重組子進行酶切鑒定，獲得噬菌粒載體pDF-D-SacB。

1.5 構(gòu)建重組質(zhì)粒pDF-SacB-HBsL和pDFSacB-HBsH

以質(zhì)粒B4HFLF為模板，用表1、表2中的兩組引物PCR分別擴增抗乙肝表面抗原抗體的κ鏈、Fd段基因，反應(yīng)條件為:95℃熱啟動2 min;95℃變性20s，65℃退火20s，72℃延伸l 5s，35個循環(huán)后72℃延伸5 min。將輕鏈和重鏈PCR產(chǎn)物用凝膠電泳分離、純化后分別用BglⅡ、XbaⅠ和NcoⅠ、NheⅠ雙酶切4 h，與同樣經(jīng)電泳分離、純化、酶切的pDF-D-SacB載體用T4 DNA連接酶16℃連接16 h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Trans1-Blue而后鋪板，分別用該4種酶進行酶切鑒定;挑取含有適當表達載體的單集落Trans1-Blue菌，接種到含100 μg/mL氨芐青霉素和10 g/L葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過液，取30 μL過夜菌接種到3 mL含100 μg/mL氨芐青霉素的SB培養(yǎng)液，37℃震蕩培養(yǎng)至A600約為0.5，加入20 μL輔助噬菌體VCSM13。30℃震蕩培養(yǎng)過夜，次日離心收集上清，取10 μL適當稀釋的上清樣品，與100 μL對數(shù)增長期的 Trans1-Blue菌混合，室溫孵育30 min，鋪含Amp的LB盤，37℃培養(yǎng)過夜，次日計數(shù)，估算滴度。

1.6 抗體基因的細胞內(nèi)重組

挑取單集落BSl365菌，在含有50 μg/mL卡那霉素和10g/L葡萄糖的2YT培養(yǎng)基中生長至對數(shù)生長期(A600=0.5)。通過滴度測定，將上述兩種噬菌體上清以相同的滴度混合，以20個噬菌體顆?！?個細胞的比例感染BS1365菌，37℃溫育60 min，加入Amp補至100 μg/mL，30℃振搖過夜。次日取過夜培養(yǎng)菌加入到3 mL含Amp的2TY培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)至 A600=0.5，加入20 μL VCSM13，37 ℃震蕩培養(yǎng)過夜。次日離心回收上清，測定噬菌體滴度，將噬菌體感染對數(shù)生長期的大腸桿菌Trans1-Blue，鋪含Amp的培養(yǎng)盤，37℃ 培養(yǎng)過夜，次日挑取單個集落，擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，通過內(nèi)切酶譜進行分析鑒定。

1.7 用酶聯(lián)免疫吸附劑測定方法檢測噬菌體

將乙肝表面抗原以pH9.8的碳酸鹽緩沖液稀釋至 7.62 μg/mL，以 50 μL/孔包被 ELISA 板，4 ℃ 過夜，次日棄去孔內(nèi)液體，以12%的脫脂牛奶100 μL 37℃封閉2 h后，PBST洗滌5次，加入待測噬菌體抗體樣本及對照，37℃孵育2 h后，再以PBST洗滌5次，加入3∶1 000稀釋的HRP-羊抗M13(Pharmacia)，37℃孵育2 h，最后PBST洗滌5次后加OPD底物顯色，讀取A450值。

2 結(jié)果

2.1 驗證SacB基因的自殺活性

在含有Amp抗性液體LB培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌，在10-1～10-5均有克隆，且10-1～10-3稀釋倍數(shù)克隆無法計數(shù)，在10-4有86個單克隆，在10-5有11個單克隆;而在含有Amp抗性及5%蔗糖液體LB培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌10-1～10-5均無克隆。表明大腸桿菌在是否含蔗糖的培養(yǎng)基環(huán)境里，生長相差5個數(shù)量級，說明PUC19-SacB質(zhì)粒帶有自殺功能，詳見圖1和圖2。

圖2 帶有PUC19-SacB質(zhì)粒的大腸桿菌在Amp平板上的生長的情況Fig.2 The growth condition of E.coli with PUC19-SacB plasmid on Amp plate

2.2 新型噬菌體抗體表達載體pDF-D-SacB的構(gòu)建

首先構(gòu)建PSBX質(zhì)粒，隨后又改變其酶切位點構(gòu)建了PSGX質(zhì)粒，最后用本室發(fā)明的回收方法［4］對SacB基因進行回收，得到了SacB基因后(圖3)，以內(nèi)切酶NcoⅠ和NheⅠ分別對PSGX和SacB基因進行酶切，隨后進行連接、轉(zhuǎn)化并隨機挑取10個單克隆提取質(zhì)粒，利用內(nèi)切酶EcoRⅠ進行鑒定(圖4)。

圖3 PCR擴增SacB基因純化回收Fig.3 PCR products of SacB gene and purification

圖4 EcoRⅠ酶切鑒定1%凝膠電泳圖Fig.4 1%agarose gel electrophoretic profile of digestion of clone with EcoR I

2.3 pDF-D-SacB細胞內(nèi)重組

為了鑒定pDF-D-SacB能否在表達Cre蛋白酶的細菌內(nèi)發(fā)生loxp和loxp511介導的重組，分別構(gòu)建了僅含抗HBsAg的輕鏈和重鏈的質(zhì)粒pDF-SacBHBsL和pDF-SacB-HBsH，并用DraⅠ酶切鑒定(圖5、圖6)，分別制備含有2者的 phagemid-噬菌體上清，等量混合后，以20個病毒顆粒∶1個細胞感染可表達Cre蛋白酶的細菌BS1365，使多副本載體進入同一個細胞，載體之間發(fā)生重組，獲取重組后的質(zhì)粒，進行內(nèi)切酶譜分析。這2種載體經(jīng)Cre-Loxp介導的重組后，應(yīng)產(chǎn)生4種不同載體，除2種親本載體外，還有同時含有輕重鏈的pDF-HBsH-L和無抗體基因的pDF-D-SacB。一共進行了9次重組實驗，鑒定了180個克隆，所獲4種載體的比例大體符合隨機重組的規(guī)律。

圖5 DraⅠ酶切鑒定1%凝膠電泳圖Fig.5 1%agarose gel electrophoretic profile of digestion of clone with Dra Ⅰ

圖6 DraⅠ酶切鑒定1%凝膠電泳圖Fig.6 1%agarose gel electrophoretic profile of digestion of clone withDraⅠ

2.4 pDF-D-SacB載體表達活性的鑒定

為了鑒定新構(gòu)建的pDF-D-SacB載體是否能表達功能性的噬菌體抗體，利用經(jīng)重組后得到的質(zhì)粒pDF-HBsH-L，用其表達噬菌體抗體，并以未插入任何基因的原始質(zhì)粒pDF載體所表達的噬菌體蛋白作為陰性對照，ELISA檢測其與HBsAg的結(jié)合活性，讀取各孔450 nm處的吸光值，結(jié)果詳見表3。pDFHBsH-L所表達的蛋白經(jīng)10倍稀釋后測得的每組數(shù)值之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，即隨著蛋白濃度的下降A(chǔ)450值也呈現(xiàn)遞減下降，說明抗原與樣品之間的結(jié)合是特異性的;而陰性對照pDF所表達的蛋白經(jīng)10倍稀釋后測得的每組數(shù)值之間差異無統(tǒng)計學意義，即隨著蛋白濃度的下降A(chǔ)450值未呈遞減下降，呈現(xiàn)無規(guī)律性，且 3，4，5，6，7 組 A450 值均低于0.1，說明抗原與樣品之間的結(jié)合是非特異性的。

表3 2種樣品濃度10倍遞減稀釋Tab.3 Two kinds of sample concentration decreasing diluted 10 times (±s)

表3 2種樣品濃度10倍遞減稀釋Tab.3 Two kinds of sample concentration decreasing diluted 10 times (±s)

The results presented as mean±standard deviation，means in the same row with completely different capital letters are significantly different(P＜0.01)，with the small letters are significantly difference(P＜0.05).

Item Diluted 10 times 1 2 3 4 5 6 7 pDF 0.167±0.0036dD 0.133±0.0036cC 0.071±0.0072abAB 0.083±0.0111bB pDF-HBsH-L 0.610±0.0100gG 0.061±0.0035aA 0.387±0.0030fF 0.293±0.0072eE 0.068±0.0061abAB 0.068±0.0080abAB 0.273±0.0046dD 0.212±0.0061cC 0.154±0.0078bB 0.127±0.0053aA

2.5 大容量噬菌體抗體庫表達載體pDF-D-SacB的鑒定

本實驗構(gòu)建pDF-D-SacB噬粒載體后，將抗乙肝表面抗原的抗體輕、重鏈基因分別克隆于該載體構(gòu)建兩個初級質(zhì)粒，而后經(jīng)重組得到噬粒載體pDF-HBsHL，再將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，以噬菌體VCSM13進行拯救，得到含有抗乙肝表面抗原的Fab段噬菌體抗體。我們利用該抗體與乙肝表面抗原作結(jié)合活性分析，并用未插入任何基因的原始噬粒pDF所表達的蛋白作為陰性對照，分別進行10倍的遞減稀釋作ELISA檢測。實驗結(jié)果顯示，包被的乙肝抗原量不變，將抗乙肝表面抗原抗體輕、重鏈基因插入到噬粒載體pDF-DSacB中，其pDF-HBsH-L噬粒表達的噬菌體蛋白與乙肝表面抗原的結(jié)合能力，要遠高于未插入任何基因時原始噬粒pDF所表達的噬菌體蛋白與乙肝表面抗原的結(jié)合能力(在每一對比組中，陽性都遠高于陰性)，且隨著特異性pDF-HBsH-L噬菌體抗體濃度的降低A450值均會下降，該值的下降程度大致呈現(xiàn)有規(guī)律的遞減一次函數(shù);而未插入任何基因的原始噬粒pDF所表達的蛋白與乙肝表面抗原的A450值則基本趨于0.1以下。理論上，由于pDF所表達的蛋白不與乙肝表面抗原相結(jié)合，遞減稀釋pDF所表達的蛋白與乙肝表面抗原結(jié)合能力應(yīng)保持在同一數(shù)值;但實驗數(shù)據(jù)顯示，在陰性對照pDF中，第7組A450值要略高于對比組3、4、5和6(對比組A450值也呈現(xiàn)一定的遞減趨勢)，而低于對比組1和2，其原因可能是由于在噬菌體純化物中存在大腸桿菌殘體，而菌體中可能含有內(nèi)源性HRP，使得對照組出現(xiàn)較低程度的非特異性著色，當倍比稀釋至102，其非特異性著色降至顯色劑本底著色OD值0.1以下。

3 討論

抗體工程領(lǐng)域中最突出的研究進展就是噬菌體抗體庫技術(shù)，該技術(shù)的出現(xiàn)開創(chuàng)了一條簡便、快捷的基因工程抗體生產(chǎn)路線［5］。本課題組在國內(nèi)外噬菌體抗體庫技術(shù)進展的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了一個適用于大容量噬菌體抗體庫的表達載體pDF-D-SacB，它具有以下特點:

3.1 在抗體庫載體輕、重鏈區(qū)域插入自殺基因

枯草芽孢桿菌中的果聚糖蔗糖轉(zhuǎn)移酶催化以蔗糖為底物合成果聚糖的反應(yīng)，其SacB基因編碼的蛋白為分泌型的蔗糖果聚糖酶，此酶能催化蔗糖，水解產(chǎn)生葡萄糖和果聚糖［6］。盡管枯草芽孢桿菌SacB基因?qū)е略S多革蘭陰性菌和革蘭陽性菌死亡的原理尚不清楚，但基因SacB已經(jīng)被用于克隆研究，而且也獲得了SacB基因轉(zhuǎn)化的煙草、番茄、楊樹［7］?；谶@種特性，SacB基因賦予細胞的蔗糖敏感特性作為一種陰性篩選克隆的標記，在生物研究中特別是在基因克隆等遺傳操作中有著廣泛的應(yīng)用［8］。Fab抗體庫的質(zhì)量很大程度上取決于抗體基因的插入效率，而在大多數(shù)情況下，抗體基因的插入效率并不很高，這樣就會產(chǎn)生很多的無效克隆，而輕鏈或重鏈中的任何一個位置沒有抗體基因插入都會導致克隆的無效，這樣就會大大增加無效克隆的比例。為了克服這一問題，本研究組擬在本室多年抗體工程研究的基礎(chǔ)上，采用可誘導的自殺基因和以國內(nèi)自主構(gòu)建且普遍使用的基于pDAN5［9］的抗體庫表達載體pDF為骨架，構(gòu)建新型、高效的pDF-D-SacB表達載體。在抗體輕鏈和重鏈的克隆位點分別引入SacB自殺基因，以此作為反向篩選基因，當抗體基因插入自殺載體后，自殺基因便失去功能;而沒有插入抗體基因的自殺載體，表達自殺基因的革蘭陰性菌，在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長時，會將蔗糖分解為對細菌有毒的產(chǎn)物，從而殺死表達自殺蛋白的細菌。因此，SacB作為反篩基因常與抗性基因等正向篩選基因聯(lián)合，用于構(gòu)建細菌的無痕缺失突變株。用這種方法構(gòu)建的抗體庫，不僅容量大，而且質(zhì)量更高，理論上可以得到近于100%的有效克隆，以避免無效克隆的產(chǎn)生。

3.2 選擇了更合理的抗體基因克隆位點

隨著抗體胚系可變區(qū)基因序列的闡明，本課題組目前廣泛應(yīng)用于噬菌體抗體庫中的表達載體內(nèi)切酶位點的選擇并不合理，因此本課題組在pDF-D-SacB中選用了抗體胚系可變區(qū)基因中不存在的內(nèi)切酶位點，以保證內(nèi)切酶序列不會影響到成熟抗體分子氨基端的序列。除此之外，PCR產(chǎn)物及噬菌粒載體兩端酶切位點的酶解效率直接影響到抗體基因的連接效率，進而影響整個抗體庫的質(zhì)量。在原噬菌粒載體pDF上用于連接輕鏈抗體基因的酶切位點BssHⅡ和XbaⅠ，酶切溫度分別是50℃和37℃，所用Buffer的離子濃度也相差甚遠，在構(gòu)建噬菌體抗體庫的試驗過程中顯示，酶切噬菌粒載體和抗體基因時，難以控制酶切的時間及酶的用量，且酶切不完全，連接效率低下，若要保證抗體庫的容量和多樣性，則必須進行多次酶切、連接和轉(zhuǎn)化，致使工作量大大地增加。為了能夠解決這一問題，通過借鑒本室對于酶切位點改造的研究［10］以及大量的實驗摸索，用上述方法將酶切位點BssHⅡ改為BglⅡ，從而極大地提高了抗體基因的連接效率，減少了工作量。

綜上所述，pDF-D-SacB在構(gòu)建后經(jīng)檢測，具有正常的噬菌體抗體表達功能，能夠在分泌Cre細菌中發(fā)生Cre-LoxP介導的同源重組，為大容量噬菌體抗體庫的構(gòu)建提供了有效工具;本實驗的數(shù)據(jù)能夠支持對表達載體pDF-D-SacB用于構(gòu)建大容量噬菌體抗體庫的定性分析，其定量分析還有待進一步研究。

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