王 鵬 許 潔 李 昕 何 欣 李堯華 于 順*

(1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林132013;2.吉林化工學(xué)院理學(xué)院，吉林132022;3.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院老年病研究所神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京100053)

神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative disease)是一類以神經(jīng)系統(tǒng)功能和結(jié)構(gòu)逐步喪失和萎縮為特征的疾病，以阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)等為代表。PD是臨床上最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，表現(xiàn)呈進(jìn)展性，目前臨床上尚無控制病程發(fā)展的有效措施，因此揭示這一疾病的機(jī)制，并采取早期診斷并預(yù)防顯得日益迫切。

PD的病理特征為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生變性壞死，以及路易小體(Lewy body)和路易軸索(Lewy neurite)的形成［1-2］。Lewy body 和 Lewy neurite 是纖維淀粉樣變的嗜酸性包涵體。人α-突觸核蛋白(αsynuclein，α-Syn)是參與形成淀粉樣變性的主要成分。α-Syn是一個(gè)具有140個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，主要分布于突觸前膜和核膜［3-5］。α-Syn與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，參與突觸形成、維持和神經(jīng)元的分化，對(duì)突觸可塑性起一定的作用，但至今尚未完全清楚。為了闡明α-Syn在PD發(fā)病中的作用，有必要明確其生理功能。

體外實(shí)驗(yàn)［6］證明，α-Syn能夠促進(jìn)微管蛋白的聚合，加速微管的形成。在PD患者腦中，α-Syn被證明與γ-tubulin、tau蛋白以及MAP1B共存于Lewy body中，α-Syn可以促進(jìn)原代培養(yǎng)的大鼠原代神經(jīng)元的突起生長［7-9］。α-Syn與上述微管蛋白的密切關(guān)系及其潛在的促進(jìn)微管形成的作用提示該蛋白有可能與神經(jīng)元突起的形成和生長有關(guān)。本研究的目的是探討比較α-Syn和其突變體對(duì)神經(jīng)元突起生長的影響，為揭示其突變體A53T和A30P導(dǎo)致PD發(fā)病的機(jī)制提供線索。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)，購自 Pierce Biotech公司;α-Syn單克隆抗體3D5，由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物研究室制備;FITC標(biāo)記的羊抗鼠抗體，購自中山公司;細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(F-12)，購自Gibco公司;胎牛血清(FBS)和馬血清(HS)，購自HyClone;蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，購自Pharmacia公司。其他均為化學(xué)分析純?cè)噭?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新生24 h Wistar大鼠36只，雌雄不限，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證:SCXK-(軍)2002-001。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1)重組蛋白的制備與純化:將人α-Syn和其突變型 A53T、A30P的 cDNA分別插入表達(dá)載體 pET(3a)，然后轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐西林的YTA培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)。所表達(dá)的基因重組型蛋白采用離子交換層析和反向?qū)游龇兓?。純化后的蛋白用SDS-PAGE法鑒定，BCA法定量。

2)原代神經(jīng)元培養(yǎng):按Kohn J Y等［10-11］創(chuàng)建的原代培養(yǎng)方法進(jìn)行改良。將新生24 h大鼠斷頭，分離鼠腦，置于D-Hank's BBS中，剝?nèi)パ苣X膜，分離皮質(zhì)，剪碎。胰酶消化45 min后吹散，篩網(wǎng)過濾。800 r/min離心2 min后棄上清，細(xì)胞沉淀用DMEM培養(yǎng)基懸浮，計(jì)數(shù)細(xì)胞密度。以0.75×105個(gè)/皿的密度接種在用多聚賴氨酸包被好的培養(yǎng)皿(φ35 mm)中，加入相應(yīng)蛋白進(jìn)行分組培養(yǎng)。

3)神經(jīng)元突起生長觀察和長度測(cè)量:培養(yǎng)至第1、2和4小時(shí)，向培養(yǎng)皿中添加終濃度為1%的戊二醛。室溫下固定1 h。隨機(jī)挑選30個(gè)視野進(jìn)行拍照，每個(gè)視野至少有5個(gè)存活的神經(jīng)元［12］。采用10倍目鏡，40倍物鏡，黑白，照片分辨率1 300×1 030，格式為TIFF。應(yīng)用Image-Pro Plus V2.0軟件測(cè)量神經(jīng)元突起的長度。

4)Western blotting法和免疫熒光法鑒定α-Syn的作用:將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基吸棄，PBS沖洗。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，超聲破碎。功率200W，30s 2次，間歇30 s。破碎后的細(xì)胞溶液加入 SDS-PAGE Running Buffer，沸水中煮 5 min。4 ℃，12 000 r/min，離心 20 min。轉(zhuǎn)移上清，取30 μL作為樣品，進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶溶液封閉，沖洗后，以1/1 000比例稀釋的3D5抗體反應(yīng)過夜。洗膜，再與1/5 000稀釋的生物素標(biāo)記的羊抗鼠抗體溶液反應(yīng)。沖洗后，ECL法顯示條帶。

將培養(yǎng)細(xì)胞，以1%的戊二醛室溫下固定1 h后，PBS沖洗培養(yǎng)皿。以含10%羊血清的PBST溶液，室溫封閉1 h。棄封閉液，加入1/5 000稀釋的3D5抗體1.5 mL。4℃過夜，PBST沖洗。加入1/500稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠抗體，37℃，2 h;吸棄反應(yīng)液，PBST沖洗。熒光顯微鏡下觀察照相。

5)培養(yǎng)分組方案:向原代神經(jīng)元培養(yǎng)基中添加終濃度為 20 μmol/L 的 α-Syn、突變型 A53T、A30P 和BSA，培養(yǎng)至第1、2、4小時(shí)觀察。分別添加終濃度為20、40、60 和80 μmol/L 的相應(yīng)蛋白，培養(yǎng)至4 h，觀察突起長度變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組樣本均數(shù)比較采用方差分析(One-way ANOVA)，方差齊者兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用TamhanepT2檢驗(yàn)。兩組比較采用t檢驗(yàn)。兩變量的相關(guān)分析采用Bivariate過程的Pearson直線相關(guān)法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白純化鑒定結(jié)果

SDS-PAGE鑒定，經(jīng)親和層析得到純度較高的α-Syn 和 A53T、A30P，詳見圖 1。

2.2 α-Syn可促進(jìn)神經(jīng)元突起生長，A53T、A30P不能促進(jìn)突起生長

圖1 純化后蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.1 Purification of α-Syn

添加α-Syn(20 μmol/L)以及其他蛋白進(jìn)行分組培養(yǎng)，培養(yǎng)至1 h、2 h和4 h固定觀察。培養(yǎng)至1 h、2 h，添加α-Syn組的神經(jīng)元突起平均長度大于對(duì)照組(P＜0.05)，而A53T組和A30P組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。培養(yǎng)至4 h，α-Syn組神經(jīng)元突起長度明顯大于對(duì)照組(P＜0.01)，A53T組和A30P組與對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見圖2。添加不同濃度(20～80 μmol/L)的各蛋白，培養(yǎng)至4 h觀察，α-Syn組突起長度隨濃度增加而增加，而A53T組和A30P組無變化，見圖3。可見α-Syn可以促進(jìn)神經(jīng)元突起生長，其突變型A53T、A30P對(duì)突起生長無影響。

圖2 α-Syn和其突變體對(duì)神經(jīng)元突起生長的影響Fig.2 Effect of α-Syn，A30P and A53T promote on the neurite outgrowth

2.3 α-Syn可以從培養(yǎng)基進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)，A53T和

A30P不能轉(zhuǎn)入神經(jīng)元

α-Syn組神經(jīng)細(xì)胞裂解液Western blotting結(jié)果現(xiàn)清晰條帶，為陽性;A30P、A53T和對(duì)照組均為陰性，圖4A。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示α-Syn神經(jīng)元顯色清晰，在細(xì)胞內(nèi)呈廣泛、均勻分布，對(duì)照組、A53T和A30P組為陰性，見圖4B?？梢姦?Syn可以從培養(yǎng)基進(jìn)入神經(jīng)元內(nèi)，A53T和A30P不能進(jìn)入神經(jīng)元。

圖3 α-Syn組突起長度隨濃度變化情況Fig.3 α-Syn promotes neurite outgrowth of primary rat brain neurons in a dose-dependent manner.

圖4 α-Syn向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)Fig.4 Transportation of α-Syn into primarily cultured neurons

3 討論

在原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞生長初期，微管(microtubule)在神經(jīng)細(xì)胞的軸突和樹突中起支撐作用，幫助突起生長。在成熟的神經(jīng)元中，微管是物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐緩?，參與神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞。體外研究［6，13-14］證明，α-Syn具有與tau蛋白相似的作用，可以促進(jìn)微管蛋白組裝成微管。我們研究發(fā)現(xiàn)通過促進(jìn)微管的組裝，α-Syn可以促進(jìn)大鼠原代神經(jīng)元突起的生長，這一作用提示該蛋白很可能參與神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育階段神經(jīng)元突起的形成以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)［9，15-16］。而突變體 A53T和 A30P則失去這種有序的微管組裝功能，在家族PD患者的腦神經(jīng)元受到某種致病因子損傷后，由于伴侶蛋白的突變，影響微管的合成和有序排列，致使神經(jīng)元突起修復(fù)和重建障礙或軸漿轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞間或細(xì)胞內(nèi)無定形物的形成聚集。促微管聚合的作用的喪失，可能影響神經(jīng)系統(tǒng)的早期發(fā)育以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)，對(duì)揭示α-Syn突變導(dǎo)致神經(jīng)元退變的機(jī)制也有重要意義。因此我們以原代培養(yǎng)神經(jīng)元為觀察對(duì)象，研究α-Syn突變體對(duì)神經(jīng)元突起生長的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在原代神經(jīng)元培養(yǎng)4 h內(nèi)，α-Syn可促進(jìn)突起生長，A53T和A30P對(duì)突起生長無影響。Sung J Y等［17］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)α-Syn抑制H19-7大鼠海馬神經(jīng)祖細(xì)胞的增生。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，α-Syn對(duì)神經(jīng)元生長的影響僅限于突起的生長，對(duì)神經(jīng)元胞體的大小、形態(tài)沒有影響。Western blotting結(jié)果顯示添加α-Syn組細(xì)胞內(nèi)蛋白免疫反應(yīng)呈陽性，A53T組、A30P組和對(duì)照組同為陰性。免疫熒光印跡結(jié)果顯示，α-Syn在神經(jīng)元的胞體和突起呈現(xiàn)輪廓清晰的綠色熒光，這說明外源性的α-Syn在胞體和突起均有分布，分布廣泛、均勻。這與微管在細(xì)胞內(nèi)的分布一致，提示進(jìn)入細(xì)胞的α-Syn與微管蛋白之間存在伴侶關(guān)系。α-Syn分子含有7個(gè)KTKEGV不完全重復(fù)序列，該序列能夠介導(dǎo)α-Syn過細(xì)胞膜［18-19］。其N端1～60氨基酸，就含有4個(gè)重復(fù)的KTKEGV殘基，而30和53位的錯(cuò)義突變導(dǎo)致α-Syn的構(gòu)象改變不能進(jìn)入神經(jīng)元，失去與微管蛋白結(jié)合促突起生長的能力。目前，α-Syn與微管蛋白之間的共同作用關(guān)系正成為解釋PD病因的新的研究熱點(diǎn)。此研究結(jié)果為揭示α-Syn的功能，及其與微管蛋白的關(guān)系提供了新證據(jù)，對(duì)突變型α-Syn導(dǎo)致PD的病因、病理機(jī)制闡述提供了新思路。

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